Dokument: Autodisplay von Peptidbibliotheken und Screening nach Neuen Cathepsin G Inhibitoren mittels Durchflusszytometrie
| Titel: | Autodisplay von Peptidbibliotheken und Screening nach Neuen Cathepsin G Inhibitoren mittels Durchflusszytometrie | |||||||
| Weiterer Titel: | Autodisplay of peptide libraries and screening for new Cathepsin G inhibitors by flow cytometry | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=8261 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20081106-105739-7 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Deutsch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Betscheider, Dirk [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof. Dr. Jose, Joachim [Gutachter] Prof. Dr. Kassack, Matthias U. [Gutachter] | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften » 610 Medizin und Gesundheit | |||||||
| Beschreibungen: | Im Rahmen dieser Arbeit wurde Autodisplay dazu benutzt, Peptide und Peptidbiblio-theken auf der Oberfläche von E. coli zu exprimieren. Es wurde gezeigt, dass Auto-display eine Alternative zu etablierten Verfahren wie dem „Phage Display“ darstellt. Die Affinität einzelner Peptidvarianten zum Target wurde zur Markierung dieser Varianten ausgenutzt. Einzelne Varianten aus der Bibliothek wurden nach der Markierung mittels Fluoreszenz-gesteuerter Selektion im Durchflusszytometer aus-gewählt. Durch Optimierung der Markierungs- und Selektionsverfahren gelang es, eine hohe Überlebensfähigkeit der ausgewählten E. coli Zellen sicherzustellen. Die selektierten Bakterienzellen konnten wieder in Kultur gebracht werden und die Sequenz ihrer oberflächenexprimierten Peptide durch DNA-Sequenzanalyse ermittelt werden. Aus dem Screening der Bibliothek I (Größe der Bibliothek: 1,15 x 105 Varianten) wurden drei neue peptidische Hemmstoffe (Peptid 1-3) für humanes Cathepsin G ge-funden. Die Peptide 1-3 zeigten eine moderate Hemmung von humanem Cathepsin G (um 50 % bei 100 µM). Aus ihren Sequenzen konnte eine Konsensussequenz (Peptid 6 (KDIFV)) abgeleitet werden. Das Peptid 6 zeigte mit einem IC50-Wert von 11,7 µM (72 % Hemmung bei 100 µM) eine deutlich stärkere Hemmung als die Ausgangs-sequenzen. Ausgehend von Peptid 6 wurde durch rationale Veränderungen der Struktur ein neuer Peptidinhibitor (Peptid 6a (DIFFVF)) erhalten, der mit einem IC50-Wert von 9,76 µM potenter war als Peptid 6. Peptid 6a wurde als neue Leitstruktur eingesetzt und es wurden drei neue Bibliotheken (Bibliothek II, III, IV) erstellt. Aus dem Screening der Bibliothek III (Größe der Bibliothek: 3,1 x 107 Varianten) wurden zwei neue, und aus dem Screening der Bibliothek IV (Größe der Bibliothek: 1,8 x 108 Varianten) wurden fünf neue Peptidinhibitoren erhalten. Der beste aus dem Screening der Bibliotheken stammende Inhibitor war Peptid 45 (LWGLLL) mit einem IC50-Wert von 10,5 µM. Mit allen Peptiden aus dieser Arbeit wurde ein Protein-Peptid-Docking mit der Kristall-struktur von humanem Cathepsin G durchführt. Durch Auswertung der Daten aus dem Protein Peptid Docking konnte ein neues Inhibitorpeptid rational entwickelt werden (Peptid 50 (KIFFFV)). Dieses Peptid zeigte im Vergleich zur ersten Leitstruktur Peptid 15 (IC50-Wert von 6,06 µM bei Peptid 50 im Vergleich zu 8,98 µM bei Peptid 15) eine geringfügig bessere Hemmung von humanem Cathepsin G und dient zugleich als Beispiel dafür, dass es gelungen war, virtuelle und reale Methoden erfolg-reich miteinander zu kombinieren. Durch die im Rahmen dieser Arbeit erhaltenen Er-gebnisse konnte die Eignung des Autodisplay in Verbindung mit einem Protein-Peptid-Docking zur Target-orientierten Evolution im Reagenzglas gezeigt werden.Within the scope of this thesis, autodisplay was employed for expression of peptides and peptide libraries on the surface of E.coli. It was shown that autodisplay constitutes an alternative to established approaches such as “phage display”. The affinity of single peptide variants to the target was used for labelling of these variants. Single variants of the library were chosen after labelling by fluorescence-activated cell sorting in the flow cytometer. Optimised labelling and selection procedures assured a high survivability of the selected E.coli cells. Selected bacterial cells were recultured while the sequences of the peptides expressed on their surface were elucidated by DNA sequence analysis. Three new peptide inhibitors (peptide 1-3) of human Cathepsin G were identified from Library I (library size: 1.15 x 105 variants). Peptides 1-3 displayed a moderate inhibition of human Cathepsin G (approx. 50% inhibition at a concentration of 100 µM). Their sequences yielded a consensus sequence (peptide 6, KDIFV). Peptide 6 showed a con-siderably higher inhibition rate (72 % inhibition at a concentration of 100 µM with an IC50 value of 11.7 µM compared to the original sequences). Based on peptide 6, a new peptide inhibitor (peptide 6a (DIFVFV)) was developed by rational structural amend-ments which proved to be more potent than peptide 6 (IC50 value of 9.76 µM). Pep-tide 6a was utilised as new lead structure and led to establishment of three new libraries (Library II, III and IV). Screening of Library III (library size: 3.1 x 107 variants) yielded two new peptide inhibitors while five new inhibitors were found in Library IV (library size: 1.8 x 108 variants). The most promising inhibitor detected by screening of the li-braries was peptide 45 (LWGLLL) with an IC50 value of 10.5 µM. All peptides investi-gated in this thesis were subjected to protein-peptide-docking with the crystalline struc-ture of human Cathepsin G. Analysis of the data from the docking experiments led to the rational development of a new peptide inhibitor (peptide 50, KIFFFV). This peptide showed slightly improved inhibition of human Cathepsin G compared to the first lead structure peptide 15 (IC50 value of peptide 50: 6.06 µM; IC50 value of peptide 15: 8.98 µM). This serves as an example that virtual and real methods were combined suc-cessfully. The results from this work prove the feasibility of the concept of in vitro tar-get-oriented evolution. | |||||||
| Rechtliche Vermerke: | Nur Abstracts geladen! Arbeit fehlt! (ge) | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Pharmazie » Pharmazeutische und Medizinische Chemie | |||||||
| Dokument erstellt am: | 06.11.2008 | |||||||
| Dateien geändert am: | 06.11.2008 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 03.06.2008 | |||||||
| Datum der Promotion: | 04.07.2008 |
