Dokument: Strukturelle und funktionelle Charakterisierung der [NiFe]-Hydrogenase aus Allochromatium vinosum

Titel:	Strukturelle und funktionelle Charakterisierung der [NiFe]-Hydrogenase aus Allochromatium vinosum
Weiterer Titel:	Structural and functional characterization of the [NiFe] hydrogenase from Allochromatium vinosum
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=8237
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20080707-091510-6
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Kellers, Petra [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 4,38 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 27.06.2008 / geändert 27.06.2008
Beitragende:	Prof. Dr. Lubitz, Wolfgang [Betreuer/Doktorvater] Prof. Dr. Jaeger, Karl-Erich [Gutachter]
Stichwörter:	Hydrogenasen, Wasserstoff, EPR, FT-IR
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Gegenstand der vorliegenden Arbeit ist die membranassoziierte [NiFe]-Hydrogenase des Schwefel-Purpurbakteriums Allochromatium vinosum. Es ist in der Lage molekularen Wasserstoff heterolytisch zu spalten oder diesen aus Protonen und Elektronen zu generieren. Das Verständnis von Funktion und Struktur der Hydrogenasen ist Voraussetzung für die Entwicklung biotechnologischer Verfahren zur alternativen Energiegewinnung auf Wasserstoffbasis. Das isolierte und gereinigte Enzym wurde spektroskopisch charakterisiert und anschließend kristallisiert. Um ausreichende Mengen kristallisationsfähigen Proteins isolieren zu können, wurde der bakterielle Organismus erstmals in einem 1100 L Fermenter kultiviert. Durch die Verwendung einer neu entwickelten Kombination aus Soxhlet-Extraktions- und Destillationsapparatur konnte der Zellaufschluss und die Entfernung photosynthetischer Pigmente effizient gestaltet werden. Der hohe Reinheitsgrad der Hydrogenase wurde durch Optimierung der säulenchromatographischen Trennparameter erreicht und mittels SDS-PAGE und MALDI-TOF-MS nachgewiesen. Während der Präparation kam eine verbesserte Methode zur qualitativen Ermittlung der spezifischen Wasserstoffspaltungsaktivität zum Einsatz. Ergebnisse EPR- und FT-IR-spektroskopischer Charakterisierungen bestätigten die Funktionalität des Enzyms und damit die Anwendbarkeit der modifizierten Reinigungsmethode. Die Analyse der Diffraktionsmuster durchgeführter Röntgenbeugungsexperimente lässt auf eine orthorhombische Einheitszelle der Raumgruppe P21212 schließen. In die errechnete Elektronendichtekarte konnte das erste, bisher vorläufige Molekülmodell der [NiFe]-Hydrogenase eines photosynthetischen Bakteriums mit einer Auflösung von 2,50 Å eingepasst werden. Die vorliegende Struktur weist im ersten Vergleich eine hohe Ähnlichkeit zu der aus Desulfovibrio vulgaris Miyazaki F isolierten [NiFe]-Hydrogenase auf. This thesis focuses on the investigation of [NiFe]-hydrogenase from the purple sulfur bacterium Allochromatium vinosum. This enzyme is able to split molecular hydrogen heterolytically or, conversely, generates H2 from protons and electrons. Hence, it plays an essential role in hydrogen metabolism of many microorganisms, which are of great biotechnological interest. A detailed understanding of the function and structure is necessary to develop new biotechnological methods to use hydrogen as an alternative energy source. The isolated and purified protein was characterized with spectroscopic methods and subsequently crystallized. Due to the low expression of hydrogenase, the bacterial organism was grown in a 1100 L fermenter to harvest a large mass of cells in order to isolate sufficient amounts of the enzyme. The efficiency of the procedures for cell disruption and removal of photosynthetic pigments were improved with the development of a special Soxhlet extraction-distillation procedure. Improvement of the purification procedure and the use of a revised method to evaluate the specific hydrogen splitting activity led to the isolation of very pure protein, supported by SDS-PAGE and MALDI-TOF MS. The results of EPR and FT-IR spectroscopic characterization confirmed the functionality of the protein and, therefore, the applicability of the modified preparation protocol. Analysis of the diffraction pattern received from recent X-ray crystallographic experiments indicated an orthorhombic space group P21212 with the following dimensions and angles: a=205.00 Å, b=217.42 Å, c=120.44 Å and alpha, beta and gamma=90°, respectively. The calculated electron density map provided the first, still preliminary, molecular model of the membrane associated [NiFe]-hydrogenase isolated from a photosynthetic bacterium with a resolution of 2.50 Å. At first glance it shows a high similarity to the [NiFe]-hydrogenase from Desulfovibrio vulgaris Miyazaki F.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie
Dokument erstellt am:	27.06.2008
Dateien geändert am:	27.06.2008
Promotionsantrag am:	28.02.2008
Datum der Promotion:	30.04.2008