Dokument: Mechanistische Einblicke in die Wirtszellinteraktion und Zytotoxizität des RTX-Toxins MbxA aus Moraxella bovis
| Titel: | Mechanistische Einblicke in die Wirtszellinteraktion und Zytotoxizität des RTX-Toxins MbxA aus Moraxella bovis | |||||||
| Weiterer Titel: | Mechanistic Insights into Host Cell Interaction and Cytotoxicity of the RTX Toxin MbxA from Moraxella bovis | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=71233 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20251110-092846-3 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Englisch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Chacko, Feby Mariam [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof. Dr. Schmitt, Lutz [Gutachter] Prof. Dr. Hegemann, Johannes H. [Gutachter] | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 540 Chemie | |||||||
| Beschreibungen: | Zusammenfassung
RTX-Proteine (Repeats-in-ToXin) werden von gramnegativen Bakterien über das Typ-I- Sekretionssystem (T1SS) ausgeschieden und spielen eine zentrale Rolle in den Wechselwirkungen zwischen Wirt und Pathogen. Ihre Aktivität hängt typischerweise von einer posttranslationalen Acylierung, einer Ca²⁺-induzierten Faltung sowie von Membraninteraktionen ab, die durch spezifische Lipide oder Rezeptoren vermittelt werden. Diese Dissertation präsentiert eine detaillierte Charakterisierung von MbxA, einem RTX- Toxin aus Moraxella bovis, mit Fokus auf seine biochemische Aktivierung, strukturellen Eigenschaften, Membranbindungsmechanismen und zytotoxischen Effekte. Ein rekombinantes Escherichia coli-Expressionssystem wurde optimiert, um sowohl die acylierte, aktive Form von MbxA als auch das nicht-acylierte Vorläuferprotein proMbxA unter Verwendung der HlyA-Sekretionskomponenten zu reinigen. Zellbasierte Assays mit humanen Epithelzellen (HEp-2) zeigten, dass die Acylierung für die Zytotoxizität essenziell ist: MbxA induzierte einen schnellen, nicht-apoptotischen Zelltod, begleitet von einer intrazellulären Ca²⁺-Modulation und mitochondrialen Depolarisation. Bei subzytolytischen Konzentrationen wurde MbxA von den Zellen internalisiert, wobei der genaue Mechanismus der Aufnahme und die mögliche Rolle spezifischer Rezeptoren bislang ungeklärt bleiben. Biophysikalische Experimente mit Liposomen und großen unilamellaren Vesikeln (GUVs) zeigten, dass MbxA Cholesterin-haltige Membranen effizient zerstört, während cholesterinfreie Membranen weitgehend resistent sind. Die Membranbindung erfolgte selbst in Abwesenheit von Cholesterin oder Acylierung, was darauf hinweist, dass Bindung und Porenbildung zwei getrennte Schritte darstellen, die durch die Lipidzusammensetzung und den Acylierungsstatus gesteuert werden. Die Leckagekinetik deutete auf eine abgestufte, dynamische Porenaktivität hin. Sequenzanalysen identifizierten 25 Cholesterin- Erkennungsmotive (CRAC/CARC), von denen mehrere in der Nähe der Acylierungsstellen und innerhalb einer vorhergesagten hydrophoben Domäne gruppiert waren. Die Abbildung dieser Motive auf ein SAXS-verfeinertes AlphaFold2-Modell bestätigte ihre räumliche Nähe zu den membraninteragierenden Regionen. SEC-MALS-Analysen zeigten, dass Acylierung die stabile Oligomerbildung fördert, was mit der Porenassemblierung übereinstimmt, während proMbxA überwiegend monomer oder dimer vorliegt. 5 Im Vergleich zu anderen RTX-Toxinen wie HlyA und LtxA teilt MbxA die Abhängigkeit von Acylierung und Cholesterin, zeigt jedoch in vitro keine klare Rezeptorabhängigkeit. Diese Arbeit liefert neue Einblicke in die Diversität der RTX-Toxine, beschreibt einen lipidvermittelten Mechanismus der MbxA-Zytotoxizität und schafft die Grundlage für zukünftige Studien zu Struktur, Wirtspezifität und Rolle von MbxA in der Pathogenese von M. bovis.Abstract RTX (Repeats-in-ToXin) family proteins are secreted by Gram-negative bacteria via the type I secretion system (T1SS) and play key roles in host-pathogen interactions. Their activity typically depends on post-translational acylation, Ca2+ -induced folding, and membrane interactions mediated by specific lipids or receptors. This thesis presents the detailed characterization of MbxA, an RTX toxin produced by Moraxella bovis, focusing on its biochemical activation, structural features, membrane-binding properties, and cytotoxic effects. A recombinant Escherichia coli expression system was optimized to purify both the acylated, active form of MbxA and its non-acylated precursor, proMbxA, using the HlyA secretion components. Cell-based assays in human epithelial (HEp-2) cells demonstrated that acylation is essential for cytotoxicity, with MbxA inducing rapid, non-apoptotic cell death accompanied by intracellular Ca2+ modulation and mitochondrial depolarization. At subcytolytic concentrations, MbxA was internalized by cells, although the mechanism of uptake and the role of specific receptors remain unknown. Biophysical assays with liposomes and giant unilamellar vesicles (GUVs) showed that MbxA efficiently disrupts cholesterol-containing membranes, while cholesterol-free membranes are largely resistant. Membrane binding occurred even in the absence of cholesterol or acylation, suggesting that binding and pore formation are distinct steps governed by lipid composition and acylation status. Leakage kinetics indicated graded, dynamic pore activity. Sequence analysis identified 25 cholesterol-recognition motifs (CRAC/CARC), several of which were clustered near the acylation sites and within a predicted hydrophobic domain. Mapping onto a SAXS-refined AlphaFold2 model supported their spatial proximity to membrane-interacting regions. SEC-MALS analysis confirmed that acylation promotes stable oligomer formation, consistent with pore assembly, whereas proMbxA remains monomeric or dimeric. When compared with other RTX toxins such as HlyA and LtxA, MbxA shares the requirement for acylation and cholesterol but does not display clear receptor dependence in vitro. This work provides new insights into RTX toxin diversity, defines a lipid-driven mechanism of MbxA cytotoxicity, and establishes a foundation for future studies on its structure, host specificity, and role in M. bovis pathogenesis. | |||||||
| Lizenz: |  Dieses Werk ist lizenziert unter einer Creative Commons Namensnennung 4.0 International Lizenz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Chemie » Biochemie | |||||||
| Dokument erstellt am: | 10.11.2025 | |||||||
| Dateien geändert am: | 10.11.2025 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 03.09.2025 | |||||||
| Datum der Promotion: | 27.10.2025 |
