Dokument: Enzymatic and chemical synthesis of sequence-defined macromolecules presenting oligosaccharides

Titel:	Enzymatic and chemical synthesis of sequence-defined macromolecules presenting oligosaccharides
Weiterer Titel:	Enzymatische und chemische Synthese von sequenzdefinierten Oligosaccharid-funktionalisierten Makromolekülen
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=64833
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20240209-092130-9
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Konietzny, Patrick Benjamin [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 5,79 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 03.02.2024 / geändert 03.02.2024
Beitragende:	Prof. Dr. Hartmann, Laura [Gutachter] Prof. Dr. Urlacher, Vlada [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 540 Chemie
Beschreibungen:	Within described thesis, glycomacromolecule and glycoconjugate synthesis via solid-phase peptide synthesis (SPPS) was investigated in combination with chemoenzymatic and protection group-free glycosylation approaches. The presented studies show alternative synthetic routes to classical chemical carbohydrate synthesis for the synthesis of tailor-made molecules for the application as potential model ligands with the focus of sialylated oligosaccharides and unusual ligand motifs. Chemoenzymatic oligosaccharide-bearing macromolecules were obtained by using the method of glycosyl transfer reaction to elongate macromolecule-bound glycan motifs. Therefore, a two-enzyme one-pot approach with Neisseria meningitidis CMP-sialic acid synthase (NmCSS) and Pasteurella multocida sialyltransferase (PmST1) described by Chen group was used to convert monodisperse and sequence-defined lactose-functionalized macromolecules into 3‘-sialyllactose-functionalized (3‘-SL) target structures. The precursor synthesis was based on SPPS approach using N-Fmoc-protected amidoamine building blocks formerly developed in the Hartmann group with two distinct β-lactose derivatives LacN3 and LacOPrN3 varying in glycosidic linkage. Since PmST1 was described to catalyze both, the sialylation as well as the desialylation reaction, in-line reaction monitoring was used to adjust optimal conditions for monodisperse synthesis of multivalent products varying in linker length, valency and ligand spacing. During performed studies, it was found that PmST1 also catalyzes sialylation reaction of non-glycan substrates such as Tris(hydroxymethyl)aminomethane buffer. The formation of this novel Tris-sialoside conjugate was found to be an irreversible enzymatic reaction which was further exploited in a separate study. Hence, structurally similar derivatives with Tris(hydroxymethyl)methyl motif were synthesized carrying functional handles for potential conjugation. First synthetic precursors bearing azide or alkyne groups were used for enzymatic sialylation via PmST1 but did not show sufficient reversed phase HPLC separation properties. The development of more hydrophobic derivatives with C6 aliphatic or aromatic motifs led to better separations but were found to show only low sialylation conversions. First attempts of small preparative scales showed the formation of sialylated products but the subsequent product isolation via HPLC did not work out. Further trials on product isolation as well as product characterization are still required as a project outlook as well as functional studies on the stabilities of this novel class of neoglycoconjugates. Another approach of synthesizing oligosaccharide-functionalized precision macromolecules was developed based on N-methyloxyamine glycosylation reaction previously described by Blixt and co-workers. Functional linkers were derivatized and azidated to allow for macromolecule conjugation via copper-catalyzed azide-alkyne cycloaddition (CuAAC). In these works, different scaffolds were obtained based on these linker constructs: SPPS-derived macromolecules and preactivated polymers as well as multifunctional symmetrical N-Boc-methyloxyamines. After precursor deprotection, the molecules occur in a preactivated form which allows for glycosylation with non-functionalized oligosaccharides under mild, aqueous, buffered conditions. This method was used to build up a glycoconjugate bibliography of a total of approx. 60 compounds. On the example of selected precursors it was shown that heteromultivalent glycosylation reactions can be used for easily synthesizing glycoconjugates with unusual glycan pairs such as 3‘-sialyllactose and 2‘-fucosyllactose. The developed method benefits from the applicability without the need of advanced preparative experience on carbohydrate synthesis. In der vorliegenden Dissertation wurde die Synthese von Glykomakromolekülen und Glykokonjugaten über den Festphasensynthesen-Ansatz (SPPS) untersucht und in Kombination mit chemoenzymatischen und schutzgruppenfreien Glykosylierungsmethoden eingesetzt. Die gezeigten Studien zeigen alternative Syntheserouten auf zur klassisch chemischen Kohlenhydratsynthese und können für die Synthese von maßgeschneiderten Molekülen eingesetzt werden, die sich als potenzielle Modellliganden eignen; hier im Speziellen lag der Fokus auf sialylierte Oligosaccharide und auf unübliche Ligandenmotive. Chemoenzymatisch konnten Oligosaccharid-funktionalisierte Makromoleküle erhalten werden, indem mit einer Glykosyltransferreaktion gearbeitet wurde, die Makromolekül-konjugierte Disaccharidmotive selektiv verlängert haben. Hierfür wurde eine Zwei-Enzym-Eintopf-Synthese mit Neisseria meningitidis CMP-Sialinsäure-Synthase (NmCSS) und Pasteurella multocida Sialyltransferase (PmST1) genutzt, ehemals beschrieben durch die Chen Gruppe, um hier monodisperse und sequenzdefinierte Lactose-funktionalisierte Makromoleküle in 3‘-Sialyllactose-funktionalisierte (3‘-SL) Zielstrukturen umzusetzen. Die Precursorsynthese basierte auf dem SPPS-Verfahren, für das in der Hartmann-Gruppe entwickelte N-Fmoc-geschützte Amidoamin-Synthesebausteine genutzt wurden sowie zwei verschiedene β-Lactose-Derivate LacN3 und LacOPrN3, die sich in ihrer glykosidischen Verknüpfung unterscheiden. Da das Enzym PmST1 als multifunktionales Enzym beschrieben wurde, das sowohl die Sialylierungs- als auch die Desialylierungsreaktion katalysiert, wurde eine Inline-Reaktionskontrolle verwendet. Dies wurde benötigt, um optimale Bedingungen für die monodisperse Synthese multivalenter Produkte einzustellen, die sich in der Linkerlänge, der Valenz und dem Ligandenabstand unterschieden. Während der durchgeführten Arbeit wurde gefunden, dass die PmST1 ebenfalls Sialylierungsreaktionen von Nicht-Glykan-Substraten katalysiert wie zum Beispiel Tris(hydroxymethyl)aminomethan-Puffer. Die Bildung dieses neuartigen Tris-Sialosid-Konjugats entstand aus einer irreversiblen enzymatischen Reaktion und wurde in weiteren Studien näher untersucht. In diesem Kontext wurden funktionalisierte Tris(hydroxymethyl)methyl-Derivate synthetisiert, die anschließend für potentielle Konjugationen genutzt werden können. Erste synthetische Precursoren mit Azid- oder Alkin-Gruppen wurden mit PmST1 enzymatisch sialyliert, jedoch konnten keine ausreichenden Produkttrennungseigenschaften mittels Reversed-Phase-HPLC beobachtet werden. Die Sialylierung von hydrophoberen Tris(hydroxymethyl)methyl-Derivaten mit aliphatischen C6-Ketten oder aromatischen Strukturmotiven zeigten zwar bessere Auftrennungsverhalten, jedoch gleichzeitig nur schwache Sialylierungsumsätze. Die ersten kleinen präparativen Ansätze zeigten die Bildung der erwarteten sialylierten Produkte, jedoch war die anschließende HPLC-Aufreinigung im Rahmen dieser Arbeit erfolglos. Weitere Versuche zur Produktisolation, der anschließenden Produktcharakterisierungen sowie funktionale Studien zur Stabilität dieser neuen Neoglykokonjugat-Klasse sind Teil des Projektausblicks. Ein weiterer Ansatz für die Synthese Oligosaccharid-funktionalisierter Präzisionsmakromoleküle wurde entwickelt basierend auf die von Blixt und Mitarbeitern beschriebene N-Methyloxyamin-Glycosylierungsreaktion. Es wurden funktionalisierte Linker-Derivate synthetisiert und azidiert, sodass eine einfache Makromolekülkonjugation über die Kupfer-katalysierte Azid-Alkin-Cycloaddition (CuAAC) ermöglicht wurde. In dieser Arbeit wurden verschiedene Makromolekülstrukturen auf Basis dieser beschriebenen Linker erhalten: SPPS-basierte Makromoleküle, präaktivierte Polymere und multifunktionale symmetrische N-Boc-Methyloxyamine. Nach der Precursor-Entschützung lagen die Moleküle in präaktivierter Form vor, die die anschließende Glykosylierungsreaktion mit unfunktionalisierten Oligosacchariden unter milden, wässrig gepufferten Bedingungen ermöglichte. Diese Methode wurde verwendet, um eine Glykokonjugat-Substanzbibliothek von ungefähr 60 Verbindungen aufzubauen. Am Beispiel der verwendeten Precursoren wurde ebenfalls gezeigt, dass heteromultivalente Glykosylierungsreaktionen durchgeführt werden können und dass hiermit vergleichsweise einfach Glykokonjugate mit ungewöhnlichen Glykankombinationen wie zum Beispiel 3‘-Sialyllactose und 2‘-Fucosyllactose synthetisiert werden können. Die entwickelte Methode profitiert von der grundsätzlichen Anwendbarkeit ohne, dass vertiefte präparative Erfahrung zur Kohlenhydratsynthese vorausgesetzt wird.
Lizenz:	Dieses Werk ist lizenziert unter einer Creative Commons Namensnennung 4.0 International Lizenz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Chemie » Organische Chemie und Makromolekulare Chemie
Dokument erstellt am:	09.02.2024
Dateien geändert am:	09.02.2024
Promotionsantrag am:	15.08.2023
Datum der Promotion:	10.01.2024