Dokument: Novel tools for the implementation of synthetic biosynthesis pathways in Rhodobacter capsulatus

Titel:	Novel tools for the implementation of synthetic biosynthesis pathways in Rhodobacter capsulatus
Weiterer Titel:	Neue Werkzeuge für die Implementierung synthetischer Biosynthesewege in Rhodobacter capsulatus
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=62745
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20230530-112255-0
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Klaus, Oliver [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 57,87 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 25.05.2023 / geändert 25.05.2023
Beitragende:	Prof. Dr. Jaeger, Karl-Erich [Gutachter] Jun.-Prof. Dr. Axmann, Ilka M. [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Terpenoids represent the largest group of secondary metabolites comprising various properties and activities. Due to the enormous diversity as well as manifold applications of terpenoids, their microbial production is of growing importance for the biotechnological industry. As consequence of their complex biosyntheses, bioprocesses, and product properties, it is necessary to optimize the microbial production methods, even in already established hosts. Moreover, the evaluation and engineering of alternative new platform organisms with novel capabilities is crucial to expand the existing portfolio of producible terpenoids. The purple non-sulfur bacterium Rhodobacter capsulatus has already been validated as a suitable production chassis for plant sesquiterpenes utilizing classical metabolic engineering concepts. Based on these initial results, more complex terpenoids may now be produced and a gradual control of gene expression may be beneficial. Additionally, for complex biosynthetic pathways, a compartmentalization, or stabilization of key enzymes can be beneficial reducing the accumulation of toxic intermediates, which might normally limit the cell viability and product yields. The present work aims to broaden the applicability of R. capsulatus as a production host for different terpene classes and to improve their biosynthesis at different cellular levels. Hence, by [I] applying different metabolic engineering strategies for increased precursor availability, the sesquiterpene  caryophyllene, the diterpene casbene, the triterpene squalene, and the tetraterpene -carotene could successfully synthesized in R. capsulatus. Besides the availability of precursor molecules, [II] the selective control of cellular processes, e.g., via precise gradual control over target gene expression, was established in order to improve the efficiency of complex biosynthetic pathways. For this purpose, a broad host range Ptac-based vector system was implemented in R. capsulatus and applied in combination with photocaged IPTG derivatives with diverging water solubility to achieve light-controlled gene expression. As a proof of concept, the synthesis of the intrinsic carotenoid biosynthesis was successfully regulated by light. Subsequently, the general applicability of this light-controllable expression system was demonstrated by transfer to other industrially relevant bacterial hosts such as Escherichia coli, Bacillus subtilis, and Pseudomonas putida. Immobilization of enzymes on the surface of appropriate carrier materials can lead to protein stabilization and improved substrate channeling, thereby enhancing product yields and reducing the accumulation of potentially toxic intermediates. Therefore, [III] granules of the biopolymer polyhydroxybutyrate (PHB) were identified as promising bioplastic material particularly suited for the in vivo immobilization of recombinant enzymes in bacteria. R. capsulatus is naturally capable to form PHB granules, which were successfully functionalized for the first time in this phototrophic bacterium by attaching the fluorescent protein eYFP to the PHB granule surface. Since validation and optimization of in vivo attachment of the target protein to the biopolymer matrix is a laborious process, it would be a tremendous benefit to online-monitor and quantify this event in living cells during the production and immobilization process. To this end, [IV] an alternative linker for in vivo protein immobilization was developed in the non-native PHB producer E. coli combining the split GFP system and PHB technology. This new linker system offers a biosensor function that allows the in vivo detection of the target protein attachment to the biopolymer surface. In this work, the heterologous terpene production in R. capsulatus was extended to different terpene classes and a Ptac-based vector system was implemented allowing light-induced gene expression and thus providing a method for the precise regulation of heterologous terpene biosynthesis. By successfully decorating PHB granules and developing a new linker/sensor system, the in vivo immobilization and simultaneous in vivo monitoring of the coupling process became possible. Hence, a cornerstone was laid for improving terpene biosynthesis in R. capsulatus using the PHB technology for enzyme scaffolding. Terpenoide stellen die größte Gruppe der Sekundärmetabolite dar und weisen eine Vielzahl an Eigenschaften und Aktivitäten auf. Aufgrund der enormen Diversität und zahlreichen Anwendungsmöglichkeiten ist deren mikrobielle Produktion von immer größer werdender Bedeutung in der biotechnologischen Industrie. Infolge der Komplexität der zugrundeliegenden Biosynthesen, Produkteigenschaften und Bioprozesse ist es erforderlich, die Herstellungsverfahren in bereits etablierten Wirten weiter zu optimieren. Darüber hinaus sind die Bewertung und Entwicklung alternativer Mikroorganismen als neue Plattformorganismen mit neuartigen Fähigkeiten von entscheidender Bedeutung für die Erweiterung des bestehenden Portfolios an herstellbaren Terpenoiden. Das Nicht-Schwefel Purpurbakterium Rhodobacter capsulatus wurde bereits initial auf seine Eignung als Produktionschassis für die Biosynthese pflanzlicher Sesquiterpene mit Hilfe klassischer metabolic engineering Konzepte evaluiert. Auf Grundlage dieser ersten Ergebnisse können nun komplexere Terpenoide produziert werden, zudem könnte eine graduelle Kontrolle der Genexpression besonders in Bezug auf komplexe Biosynthesewege von Vorteil sein. So kann beispielsweise eine Kompartimentierung oder Stabilisierung von Schlüsselenzymen die Anhäufung toxischer Intermediate verringern, die normalerweise die Zellvitalität und Produktausbeute negativ beeinflussen könnten. Das Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, R. capsulatus als Wirt für die Produktion verschiedener Terpenklassen zu etablieren und deren Biosynthese auf verschiedenen zellulären Ebenen zu verbessern. So konnten durch [I] die Anwendung unterschiedlicher metabolic engineering Strategien, mit dem Ziel einer erhöhten Verfügbarkeit von Vorstufenmolekülen, das Sesquiterpen -Caryophyllen, das Diterpen Casben, das Triterpen Squalen und das Tetraterpen -Caroten erfolgreich in R. capsulatus produziert werden. Daneben wurden [II] Methoden zur selektiven Steuerung zellulärer Prozesse, beispielsweise über eine präzise, schrittweise Kontrolle der Zielgenexpression etabliert, um so die Effizienz der komplexen Biosynthesewege zu verbessern. Hierfür wurde ein Ptac-basiertes Vektorsystem mit breitem Wirtsspektrum in R. capsulatus implementiert und schließlich mit photocaged IPTG-Varianten mit unterschiedlicher Wasserlöslichkeit eingesetzt, um eine lichtgesteuerte Genexpression zu ermöglichen. Hierdurch gelang es, die intrinsische Carotinoidbiosynthese erfolgreich durch Licht zu regulieren. Anschließend wurde durch den Transfer auf andere industriell relevante bakterielle Wirte wie Escherichia coli, Bacillus subtilis und Pseudomonas putida die allgemeine Anwendbarkeit dieses Licht-gesteuerten Expressionssystems nachgewiesen. Die Immobilisierung von Enzymen auf der Oberfläche geeigneter Trägermaterialien kann zu einer Stabilisierung des jeweiligen Proteins und zu erleichtertem Substratfluss führen, wodurch sich die Produktausbeute erhöht und die Akkumulation von (toxischen) Intermediaten verringert werden kann. Daher wurden [III] Granula des Biopolymers Polyhydroxybutyrat (PHB) als vielversprechendes bioplastisches Material identifiziert, welches sich besonders für die in vivo Immobilisierung rekombinanter Enzyme in Bakterien eignet. R. capsulatus ist natürlicherweise in der Lage PHB-Granula zu bilden und in dieser Arbeit wurden diese Biopolymere zum ersten Mal erfolgreich in diesem phototrophen Bakterium funktionalisiert, indem das fluoreszierende Protein eYFP an die PHB-Oberfläche angelagert wurde. Da die Validierung und Optimierung der erfolgreichen Bindung des Zielproteins and die Immobilisierungsmatrix in vivo ein aufwendiger Prozess ist, wäre es wünschenswert, diesen Vorgang in lebenden Zellen während des Herstellungs- und Immobilisierungsprozesses online zu überwachen und zu quantifizieren. Zu diesem Zweck wurde [IV] ein alternativer Linker für die in vivo Proteinimmobilisierung in dem nicht nativen PHB-Produzenten E. coli entwickelt, der das split GFP-System und die PHB-Technologie kombiniert. Dieses neue Linkersystem bietet eine Biosensorfunktion, die den in vivo Nachweis der Bindung des Zielproteins an die Biopolymeroberfläche ermöglicht. In der vorliegenden Arbeit wurde die heterologe Terpenproduktion in R. capsulatus auf verschiedene Terpenklassen erweitert und ein Ptac-basiertes Vektorsystem implementiert, welches eine lichtinduzierte Genexpression ermöglicht und damit eine präzise Regulation der heterologen Terpenbiosynthese erlaubt. Durch die erfolgreiche Dekoration der PHB-Granula und die Entwicklung eines neuen Linker-/Sensorsystems wurde die in vivo Immobilisierung und gleichzeitige in vivo Überwachung des Kopplungsprozesses ermöglicht. Damit wurde der Grundstein für die Verbesserung der Terpenbiosynthese in R. capsulatus unter Verwendung der PHB-Technologie zur Immobilisierung von Enzymen gelegt.
Lizenz:	Dieses Werk ist lizenziert unter einer Creative Commons Namensnennung 4.0 International Lizenz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Enzymtechnologie
Dokument erstellt am:	30.05.2023
Dateien geändert am:	30.05.2023
Promotionsantrag am:	01.12.2022
Datum der Promotion:	30.03.2023