Dokument: Biochemical characterization of RAS-like proteins and their modulators
| Titel: | Biochemical characterization of RAS-like proteins and their modulators | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=61963 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20230223-110252-8 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Englisch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Mosaddeghzadeh, Niloufar [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof. Dr. Ahmadian, Reza [Gutachter] Prof. Dr. Groth, Georg [Gutachter] | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie | |||||||
| Beschreibungen: | Die Superfamilie der RAS-GTPasen spielt bei verschiedenen zellulären Prozessen wie Proliferation, Differenzierung, Trafficking, Adhäsion und Migration eine wichtige Rolle. RAS GTPasen wechseln zwischen GDP-Bindung (inaktiver Zustand) und GTP-Bindung (aktiver
Zustand), was durch zwei Klassen von Proteinen - GAPs und GEFs - reguliert wird, die die langsame intrinsische GTP-Hydrolyse beschleunigen bzw. die langsamen intrinsischen Nukleotidaustauschraten fördern. Aktivierte RAS-GTPasen arbeiten mit ihren nachgeschalteten Effektoren zusammen, um ihre zellulären Funktionen zu erfüllen, und eine Störung ihrer Funktionen wird häufig bei Krebs und Entwicklungsstörungen, den so genannten RASopathien, beobachtet. Neuartige Mutationen in ARF3-GTPasen wurden bei Patienten mit verschiedenen Stufen der Neurodegeneration identifiziert. Unsere strukturell-funktionellen Analysen der ARF3-Varianten zeigten, dass ihre Nukleotidaustauschraten drastisch erhöht waren. Wir konnten nachweisen, dass die entdeckten Varianten in der Nukleotidbindungstasche lokalisiert sind, was die Proteinfunktionen beeinträchtigt, indem sie das Protein in GTP-gebundener Form stabilisiert und anschließend die Golgi-Integrität stört. Die HRAS-Keimbahnmutationen, insbesondere die Gly12Ser-Substitution, führen zu den konstitutiv aktiven Formen von HRAS und werden mit dem Costello-Syndrom, einer komplexen Entwicklungsstörung, in Verbindung gebracht. Es ist bereits bekannt, dass aktives HRAS mit RIN1 interagiert und die Aktivierung der RAB5-GTPasen sowie der ABL1/2-Tyrosinkinasen verstärkt, die Signalmodulatoren bei endosomalen Sortier- und Zytoskelettdynamikprozessen sind. In unserer Studie entdeckten wir, dass HRAS Gly12Ser die RIN1-abhängige RAB5A-Aktivierung erhöht und in der Folge die Konzentration und Lokalisierung von Integrinen in Keratinozyten stört, was die molekulare Pathogenese der dermatologischen Befunde beim Costello-Syndrom erklärt. RHO-GTPasen, eine Familie von RAS-GTPasen, verfügen über zusätzliche Regulatoren, so genannte RHOGDIs, die an ihren Isoprenoid-Anteil binden, sie von der Membran absondern und einen Zytosol-Pool von RHO-GTPasen bilden. Wir untersuchten die RHOGDI Spezifität mehrerer RHOGTPasen durch eine Struktur Funktions-Bewertung. Wir entdeckten, dass die RHOGDI Assoziation mit RHO-GTPasen auf positiv geladenen Resten und deren Nähe in der polybasischen Region und zwei verschiedenen negativ geladenen Clustern in RHOGDI beruht, die eine elektrostatische Kraft erzeugen, um RHO-GTPasen aus der Membran zu ziehen. IQGAPs sind Gerüstproteine, die mehrere Proteine zu spezifischen Komplexen zusammenbinden und die Stärke, Effizienz und Spezifität der Signaltransduktion sicherstellen. Die Charakterisierung der Interaktionsnetzwerke von IQGAP1 und 2 mit verschiedenen RHO-GTPasen zeigte, dass beide IQGAPs CDC42 und RAC1-ähnliche Proteine binden, nicht aber die anderen RHO-GTPasen, was an mehreren Resten außerhalb der Schalterregionen liegt. Eingehende Mutationsanalysen ergaben, dass die RGCT-Domäne der IQGAPs für die hochaffine Bindung an die Schalterregion von CDC42 verantwortlich ist. Unsere Studien haben gezeigt, dass die GRD-Domäne von IQGAPs in direktem Kontakt mit der Insertionshelix von CDC42 steht und auf nukleotidunabhängige Weise an CDC42 bindet.The RAS GTPases superfamily manifests several roles in diverse cellular processes such as proliferation, differentiation, trafficking, adhesion, and migration. RAS GTPases cycle between being GDP bound (inactive state) and GTP bound (active state), which is regulated by two classes of proteins – GAPs and GEFs – which accelerate the slow intrinsic GTP hydrolysis and promote the slow intrinsic nucleotide exchange rates, respectively. Activated RAS GTPases associate with their downstream effectors to wind up their cellular functions, and perturbation in their functions is often reported in cancer and developmental disorders, so-called RASopathies. Novel mutations in ARF3 GTPases were identified in patients suffering from different levels of neurodegeneration. Our structural-functional analyses of ARF3 variants indicated that their nucleotide exchange rates had increased drastically. We were able to prove that the discovered variants are located in the nucleotide-binding pocket, which interferes with the protein functions by stabilizing the protein in GTP-bound form, and subsequently disturbs the Golgi integrity. The HRAS germline mutations, in particular Gly12Ser substitution, lead to the constitutively active forms of HRAS and are associated with Costello syndrome, a complex developmental disorder. It was already known that active HRAS interacts with RIN1 and enhances the RAB5 GTPases activation, as well as ABL1/2 tyrosine kinases, which are signaling modulators in endosomal sorting and cytoskeletal dynamics processes. In our study, we discovered that HRAS Gly12Ser elevates the RIN1-dependent RAB5A activation, and subsequently disturbs the integrins concentration and localization in keratinocytes, which underly the molecular pathogenesis for dermatological findings in Costello syndrome. RHO GTPases, a family of RAS GTPases,have extra regulators, so-called RHOGDIs, which bind to their isoprenoid moiety and sequester them away from the membrane and establish a cytosol pool of RHO GTPases.We inspected the RHOGDI specificity of several RHO GTPases through a structure-function assessment. We discovered that the RHOGDI association with RHO GTPases relies on the positively charged residues and their proximity in the polybasic region and two distinct negatively charged clusters in RHOGDI, which create an electrostatic force to extract RHO GTPases from the membrane. IQGAPs are scaffold proteins, which tether several proteins into specific complexes and safeguard the strength, efficiency, and specificity of signal transduction. Characterization of IQGAP1 and 2 interaction networks with various RHO GTPases showed that both IQGAPs bind CDC42 and RAC1-like proteins, but not the other RHO GTPases due to several residues outside the switch regions. In-depth mutational analyses clarified that the RGCT domain of IQGAPs is responsible for high-affinity binding to the switch region of CDC42. Our studies proved that the GRD domain of IQGAPs is in direct contact with the insert helix of CDC42 and binds to CDC42 in a nucleotide-independent manner. | |||||||
| Lizenz: |  Dieses Werk ist lizenziert unter einer Creative Commons Namensnennung 4.0 International Lizenz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Medizinische Fakultät » Institute » Institut für Biochemie und Molekularbiologie II | |||||||
| Dokument erstellt am: | 23.02.2023 | |||||||
| Dateien geändert am: | 23.02.2023 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 08.11.2022 | |||||||
| Datum der Promotion: | 03.02.2023 |
