Dokument: Prospektive Studie zur klinischen Wertigkeit einer Multiplex PCR (fuPCR) für die Detektion von invasiven Mykosen bei immunsupprimierten Patienten

Titel:	Prospektive Studie zur klinischen Wertigkeit einer Multiplex PCR (fuPCR) für die Detektion von invasiven Mykosen bei immunsupprimierten Patienten
Weiterer Titel:	Prospective study on the clinical value of multiplex PCR (fuPCR) for the detection of invasive mycoses in immunocompromised patients.
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=60920
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20221020-110951-3
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Scharf, Sebastian Alexander [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 2,98 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 14.10.2022 / geändert 14.10.2022
Beitragende:	Prof. Dr. Haas, Rainer [Gutachter] Prof. Dr. Kalscheuer, Rainer [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Das Ziel dieser Arbeit war die Optimierung der Pilzdiagnostik für Patienten mit hämatologischen Neoplasien. Dafür wurde ein Assay von Multiplex Realtime-PCR-Reaktionen genutzt, welches unter der Bezeichnung „fuPCR“ ein Spektrum von mehr als 20 klinisch relevanten Pilzarten in einem einzigen Durchlauf differenzieren kann. Im ersten Schritt wurde das diagnostische Routineprotokoll für die Präparation von Hefen und Schimmelpilzen, welches eine Behandlung mit flüssigem Stickstoff, einer Proteinase K Lyse sowie die DNA-Aufreinigung mit dem „EZ1-DNA-Tissue-Kit“ und dem EZ1-BioRobot umfasste, um mechanisches „Bead beating“ erweitert. Einmaliges „Bead beating“, gefolgt von Proteinase K Lyse und EZ1-Aufarbeitung führte zu der höchsten DNA-Freisetzung aus Pilzen in einer Puffer-Lösung. Diese Methode erhöhte die extrahierte DNA-Menge im Vergleich zur alleinigen EZ1-Aufarbeitung von C. glabrata um das 100-fache und von A. fumigatus um das 10-fache. In respiratorischem Spülwasser und Blut wurde die größte Steigerung an DNA-Freisetzung mit dreifachem „Bead beating“ unter gleichzeitiger Proteinase K Lyse gemessen. Die DNA-Freisetzung von C. glabrata stieg im respiratorischen Spülwasser um das > 100-fache und im Blut um das > 1000-fache und von A. fumigatus um das > 10-fache im respiratorischen Spülwasser und im Blut um das 5- bis 10-fache. Diese Ergebnisse belegen recht eindrucksvoll die hohe Effizienz des „Bead beating“ für die DNA-Extraktion und gleichzeitig auch, dass eine Behandlung der Proben mit flüssigem Stickstoff entbehrlich ist. Die Vorteile eines verbesserten DNA-Aufschlusses für den fuPCR-Assay wurden daraufhin in einer klinischen Studie untersucht. Dazu wurden Proben aus respiratorischem Spülwasser, antikoaguliertem EDTA-Vollblut, Serum und Plasma von 94 Patienten mit hämatologischen Grunderkrankungen und 40 gesunden Kontroll-Probanden gesammelt und mittels Kultivierung auf Agarplatten, serologischer Diagnosemethoden sowie dem fuPCR-Assay auf die Präsenz von Pilzen untersucht. Der Nachweis von Pilzen der Gattung Candida war besonders durch die Kultivierung von respiratorischem Spülwasser sowie durch positive Antikörper-Nachweise im Serum sowohl bei den Patienten (61% bzw. 47%) als auch in der Kontrollgruppe (29% bzw. 51%) möglich. Der diagnostische Nutzen des durch den optimierten Aufschluss verbesserten fuPCR-Assays zeigte sich darin, nun auch andere pathogene Hefen, wie Cryptococcus und Trichosporon sowie Schimmelpilze, wie Fusarium, aufspüren zu können. Diese Pilzspezies ließen sich im respiratorischen Spülwasser als auch im Vollblut und Serum ausschließlich bei Patienten nachweisen. Eine weitere Verbesserung der fuPCR wurde durch die Entwicklung von TaqMan-Sonden erreicht. Die Sonde Pan-S wurde so konzipiert, dass sie für die Reaktionen A, D, E, F und G verwendet werden kann. Durch die Entwicklung der drei Varianten von Pan-S, Rhizo-S, Absgla-S und Lichchor-S, konnten auch die Reaktionen B und C als TaqMan-Ansatz durchgeführt werden, wodurch eine erhöhte Spezifität der Reaktionen erzielt werden konnte. Der damit verbundene Verlust an Sensitivität konnte durch die verbesserte Auswertbarkeit kompensiert werden, so dass es per Saldo zu keiner Änderung des Detektionslimits für die Reaktionen gekommen ist. So waren Linearität und Effizienz der Amplifikation mit Sonde gleichwertig oder sogar besser als ohne diese. Nicht zuletzt da sich die Sonden-basierte fuPCR für die Detektion von Pilzen in klinischen Probenmaterialien bereits als geeignet erwiesen hat, favorisieren wir für die fuPCR die Umstellung von einem SYBRGreen-basierten auf einen TaqMan-basierten Ansatz. In der Zusammenschau betrachte ich den optimierten fuPCR-Assay als eine wertvolle Ergänzung zu den etablierten Methoden der Pilzdetektion, insbesondere was die ansonsten nur schwer detektierbaren Pilz-Spezies wie Cryptococcus, Trichosporon und Fusarium betrifft. Neben einer verbesserten Diagnostik im Erkrankungsfall erlaubt die fuPCR aufgrund ihrer hohen Sensitivität die Früherkennung dieser pathologisch relevanten Pilze. Diese spielen besonders bei schwer immundefizienten Patienten, wie denen mit hämatologischen Neoplasien, eine nicht zu unterschätzende Rolle und bedürfen einer möglichst frühzeitigen und Spezies-spezifischen Therapie. Deshalb plädiere ich für die Einführung des fuPCR-Assay mit dem verbesserten Aufschlussverfahren in die mykologische Routinediagnostik. Für eine rationale Bewertung des finanziellen und personellen Ressourcen-Aufwands mit dem erwartbaren Nutzen, sollte festgelegt werden, zu welchem Zeitpunkt innerhalb des Therapieverlaufs eine solche erweiterte Diagnostik indiziert ist. Aus meiner Sicht böte es sich an, ein erstes Probenset – bestehend aus Rachenspülflüssigkeit und Vollblut - vor Beginn einer zytostatischen Behandlung zu gewinnen und danach ein weiteres in der Phase des Zellnadirs, ganz gleich, ob der Patient asymptomatisch ist oder Zeichen einer Infektion zeigt, zu gewinnen. Im letzteren Falle ist eine solche Probennahme ohnehin angezeigt. Über das rein mikrobielle diagnostische Rüstzeug hinaus, wird die immer subtilere Bildgebung mit der Möglichkeit einer auf dem Einsatz von künstlicher Intelligenz basierenden Auswertung mittels maschinellen Lernens zu einer höheren Spezifität bei der Pilzdiagnostik führen. Diese Entwicklungen gilt es im Sinne einer interdisziplinären Gesamtschau zu bündeln. The aim of this work was to optimise fungal diagnostics for patients with hematologic neoplasms. For this purpose, an assay of multiplex real-time PCR reactions was used which has been established as "fuPCR" and which can differentiate a spectrum of more than 20 clinically relevant fungal species in a single run. In the first step, the routine diagnostic protocol for yeast and mould preparation, which included liquid nitrogen treatment, proteinase K lysis, and DNA purification using the "EZ1 DNA Tissue Kit" and the EZ1 BioRobot, was extended to include mechanical bead beating. Single "bead beating" followed by proteinase K lysis and EZ1 purification resulted in the highest DNA release from fungi in buffer solution. This method increased the amount of DNA extracted 100-fold from C. glabrata and 10-fold from A. fumigatus compared to EZ1 purification alone. In respiratory rinse and blood, the largest increase in DNA release was measured with triple "bead beating" and simultaneous proteinase K lysis. DNA release from C. glabrata increased > 100-fold in respiratory lavage water and > 1000-fold in blood, and from A. fumigatus increased > 10-fold in respiratory lavage water and 5- to 10-fold in blood. These results demonstrate quite impressively the high efficiency of "bead beating" for DNA extraction and at the same time also that treatment of the samples with liquid nitrogen is dispensable. The advantages of improved specimen digestion for the optimised fuPCR assay were then investigated in a clinical study. For this purpose, samples were collected from respiratory lavage water, anticoagulated EDTA whole blood, serum, and plasma from 94 patients with underlying hematologic diseases and 40 healthy control subjects and examined for the presence of fungi using cultivation on agar plates, serological diagnostic methods, and the fuPCR assay. Detection of fungi of the genus Candida was particularly possible by culturing respiratory rinse water and by positive antibody detection in serum in both patients (61% and 47%, respectively) and the control group (29% and 51%, respectively). The diagnostic benefit of the fuPCR assay, which was improved by the optimised digestion, was shown to now be able to detect other pathogenic yeasts, such as Cryptococcus and Trichosporon, as well as moulds, such as Fusarium. These fungal species could be detected in respiratory rinse water as well as in whole blood and serum from patients only. Further improvement of fuPCR was achieved by the development of TaqMan probes. The Pan-S probe was designed to be used for reactions A, D, E, F, and G. The development of the three variants of Pan-S, Rhizo-S, Absgla-S, and Lichchor-S, also allowed reactions B and C to be performed as TaqMan approaches, resulting in increased specificity of the reactions. The associated loss of sensitivity was compensated by the improved evaluability, so that on balance there was no change in the detection limit for the reactions. Thus, linearity and efficiency of amplification with the TaqMan probes were equivalent or even better than without. Finally, since probe-based fuPCR was shown to be suitable for the detection of fungi in clinical sample materials, we favour switching from a SYBRGreen-based to a TaqMan-based approach for fuPCR. In summary, I consider the optimised fuPCR assay to be a valuable addition to established methods of fungal detection, especially with regard to otherwise difficult to detect fungal species such as Cryptococcus, Trichosporon and Fusarium. In addition to improved diagnostics in case of disease, the optimised fuPCR allows early detection of these pathologically relevant fungi due to its high sensitivity. These fungi play a role that should not be underestimated, especially in severely immunodeficient patients, such as those with hematologic neoplasms, and require therapy that is as early as possible and as species-specific as possible. Therefore, I advocate the introduction of the fuPCR assay with the improved digestion procedure into routine mycological diagnostics. For a rational evaluation of the financial and human resource expenditure with the expected benefit, it should be determined at which point in the course of therapy such an extended diagnostic is indicated. In my view, it would be appropriate to obtain a first set of samples - consisting of pharyngeal lavage fluid and whole blood - before the start of cytostatic treatment and then another in the cell nadir phase, independently whether the patient is asymptomatic or shows signs of infection. In the latter case, such action is indicated anyway. Beyond the purely microbial diagnostic armamentarium, the increasingly subtle imaging with the possibility of evaluation based on the use of artificial intelligence by means machine learning will lead to a higher specificity in fungal diagnosis. These developments must be bundled in the sense of an overarching interdisciplinary view.
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Fachbereich / Einrichtung:	Medizinische Fakultät » Institute » Institut für Medizinische Mikrobiologie
Dokument erstellt am:	20.10.2022
Dateien geändert am:	20.10.2022
Promotionsantrag am:	23.03.2022
Datum der Promotion:	29.09.2022