Dokument: Elucidation of the Dynamics of the Autophagosomal Membrane-Associated Protein GABARAP and Structure Calculation of Lipoprotein (CD1348) by Solution NMR Spectroscopy
| Titel: | Elucidation of the Dynamics of the Autophagosomal Membrane-Associated Protein GABARAP and Structure Calculation of Lipoprotein (CD1348) by Solution NMR Spectroscopy | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=58061 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20220131-081638-6 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Englisch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Apanasenko, Irina [Autor] | |||||||
| Dateien: |
| |||||||
| Beitragende: | Prof.Dr. Willbold Dieter [Gutachter] Jun.-Prof. Strodel, Birgit [Gutachter] | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie | |||||||
| Beschreibungen: | Membranproteine machen ungefähr ein Drittel aller endogenen Proteine aus, die von dem Großteil
aller Organismen exprimiert werden und führen einige der wichtigsten zellulären Funktionen aus. Aufgrund experimenteller Hürden, die während der Arbeit mit diesen Proteinen auftreten können, wird sind lediglich ungefähr 10 % der in Membranproteine. Die Kernspinresonanzspektroskopie (NMRSpektroskopie) von Membranproteinen ist eine einzigartige Messtechnik, um Strukturen zu lösen, Proteindynamik zu beobachten und die Bindung von Lipiden, Liganden und Wirkstoffen an den Proteinen zu validieren. Die vorliegende Arbeit beschreibt zwei Anwendungen Methoden der Lösungs- NMR Spektroskopie, auf Membran-assoziierte Proteine. Die erste Anwendung dient der Charakterisierung der Dynamik des autophagosomal Membranassoziierten Proteins GABARAP. Das aus 117 Aminosäure bestehende GABAA-Rezeptor-assoziierte Protein (GABARAP) interagiert mit verschiedenen Molekülen, um entscheidende regulatorische Funktionen im Vesikeltransport sowie bei Fusionsereignissen in der Autophagie auszuführen [1]. Enzymatische Lipidierung des C-Terminus von GABARAP erlaubt die Verankerung an Autophagieassoziierten Membranen, was zur Stabilisierung der Membran-Hemifusion nach Oligomerisierung beiträgt. Strukturauflösungen von GABARAP durch NMR und Röntgenkristallographie weisen auf eine signifikante strukturelle Heterogenität und Dynamik hin. Zuvor veröffentlichte Forschungsergebnisse zeigen, dass eine in hohen Salzkonzentrationen vorliegende Alternativstruktur des N-Terminus mit der hydrophoben Bindungsstasche eines benachbarten Moleküls interagieren kann [2]. In vivo Oligomerisierung von GAPARAP wird wahrscheinlich durch Interaktionen mit anderen Proteinen wie Tubulin oder mit Membranen induziert und stabilisiert. In der vorliegenden Arbeit wurde GABARAP an Phospholipid-Nanodisks untersucht, um eine Membran-assoziierte Umgebung zu simulieren. Um die molekularen Mechanismen von solchen multifunktionalen Proteinen zu verstehen, wird nicht nur ein Verständnis der Tertärstruktur benötigt, sondern auch der konformationellen Dynamik. Die NMR-Spektroskope ist ein leistungsstarkes Werkzeug um sowohl die Struktur als auch die Dynamik auf praktisch jeder Zeitskalierung auf atomarer Ebene zu untersuchen. Im Speziellen beschreibt schnelle Proteindynamik die Bewegung von Loop-Regionen, Seitenketten-Rotationen und lokalen atomaren Schwingungen in Auflösungsbereichen von Pico- bis Nanosekunden. Um die Dynamik von GABARAP zu bestimmen haben wir die 15N-Relaxationsraten R1, R2 und die {1H}-15N heteronuklearer Kern Overhauser Effekt (NOEs) gemessen, welche die Dynamik quantifizieren und die Konformations dynamik verschiedener Regionen der Tertiärstruktur offenbaren. Die Aminosäurereste, die in den Termini- und Loop-Bereichen zu finden sind, sind höchst mobil auf der Nanosekunden Skala. An Nanodisks verankertes GABARAP eine geringere interne Dynamik. Die Konformationsänderungen des N-Terminus in Gegenwart der Nanodisks wurde durch die Berechnung der chemischen Verschiebungen in drei Dimensionen charakterisiert. Die Untersuchung der Dynamik des Membranproteins GABARAP zusammen mit Nanodisks ist essenziell für die Charakterisierung konformationeller Änderungen auf verschiedenen Zeitskalierungen, um ein vollständiges Bild von GABARAP und seiner Rolle bei der Autophagie zu erhalten. Ein weiteres Membranprotein, das aus 178 Aminosäuren bestehende Lipoprotein CD 1348, wurde in der Resistenzmachinerie des Gram-positiven anaeroben Bakteriums Clostridium difficile entdeckt. Dieser Bakterienstamm hat eine starke Abwehr gegenüber der angeborenen Immunität des menschlichen Wirtes, wie kationische antimikrobielle Peptide (CAMPs) und verschiedene Antibiotika. Ein Operon welches für einen drei Komponenten ABC Transporter in C. difficile codiert, ist durch ein Resistenzsystem charakterisiert. Zudem ist ein Zwei-Komponenten-System, welches eine Histidin Kinase (HK) und einen Response Regulator (RR) beinhaltet, auf demselben Gencluster lokalisiert und spielt wahrscheinlich eine entscheidende Rolle in der Sensorik. Interessanterweise ist das Lipoprotein CD 1384 direkt vor dem CprABC Transporter codiert und könnte daher eine entscheidende Rolle in der Resistenz spielen. Weder die Struktur des Lipoproteins noch seine Funktion sind bisher bekannt. Die zweite Anwendung ist die Berechnung der 3D-Struktur des Lipoproteins. Andere Methoden wie Kleinwinkel-Röntgenstreuung (SAXS) sowie die theoretische Berechnung mit Hilfe der Computergestützten Methode “TopModel” wurden unabhängig benutzt, um die Lipoproteinstruktur zu generieren. Die Zuweisung der Seitenketten des Proteinrückrates wurde durch die sequenzielle Zuweisung über 3D 15N, 13C TROSY-NMR-Experimente erreicht Die Berechnung der Tertiärstruktur von Proteinen ist eine der wichtigsten Anwendungen von NMR innerhalb der Strukturbiologie. Die experimentelle 3D Struktur des Lipoproteins CD1348 wurde durch die Berechnung von Interproton-Distanzen aus NOE Daten von 3D 15N NOESY-TROSY Experimenten sowie mittels 4D 13C, 13C, NOESY HSQC Experimente erstellt. Die Proteinstruktur bestimmt die Funktion, da die die Spezifität aktiver Bereiche und Bindungsstellen von der präzisen dreidimensionalen Struktur abhängig ist. Folglich ist die Auflösung unbekannter Proteinstrukturen ein bedeutender Schritt für zukünftige Analysen von Proteinen. In der vorliegenden Arbeit wurde die Möglichkeit der Bindung von Lantibiotika mit Lipoproteinen über Titrationsexperimente mittels der Messung der chemischen Verschiebung bei verschiedenen Konzentrationen des Lantibiotikums Gallidermin analysiert. Hier wurde die chemische Verschiebung einiger Aminosäuren in der Anwesenheit des Lantibiotikums beobachtet. Die berechnete Struktur des Lipoproteins ist wichtig für ein besseres Verständnis seiner Rolle in der Resistenzmachinerie des Bakteriums C. difficile gegenüber CAMP, Antibiotika und Lantibiotika.Membrane proteins account roughly for a third of all proteins expressed by the genomes of most organisms and carry out some of the most important cellular functions. Unfortunately, due to experimental difficulties that arise during work with these proteins, only 10% of the solved structures in the protein data-based (PDB) are membrane proteins. Nuclear magnetic resonance spectroscopy (NMR) is a unique technique for determining structures, elucidating the dynamics, and studying the binding of lipids, ligands and drugs to membrane proteins. The current work shows two different applications of solution NMR for studying membrane proteins. The first application is an elucidation of the dynamics of the autophagosomal membrane-associated protein GABARAP. The 117-residue GABAA receptor-associated protein (GABARAP) interacts with various molecules to perform critical regulatory functions in vesicle transport and fusion events in autophagy [1]. Enzymatic lipidation of the C-terminus of GABARAP allows anchoring to autophagic membranes, which was reported to facilitate membrane hemifusion upon oligomerization. Structure determination of GABARAP using NMR and X-ray crystallography suggests significant conformational heterogeneity and dynamics. Some previous research shows that at high salt concentrations in crystal structure, the N-terminal domain can interact with the hydrophobic binding pockets of a neighbouring protein molecule [2]. Oligomerization of GABARAP in vivo might be induced and stabilized via interactions with the other proteins, such as tubulin, or with membranes. In this work, GABARAP was studied together with phospholipids nanodiscs in order to mimic a membrane-associated environment. Understanding the molecular mechanisms of a multifunctional protein, such as GABARAP, requires knowledge not only its tertiary structure but also of its conformational dynamics. NMR spectroscopy is a powerful tool to study structure and dynamics on virtually all time scales at atomic resolution. In particular, the fast protein dynamics describes the movement of loops, side-chain rotations, and local atomic vibrations in the time range from a picosecond to a few nanoseconds. To determine the dynamics of GABARAP anchored to a nanodisc, we have measured 15N relaxation rates R1, R2 and the {1H}-15N heteronuclear Nuclear Overhauser Effects (NOEs), which quantify the dynamics of the protein and reveal conformational dynamics of various regions of the tertiary structure. Residues in the termini and loop regions are highly mobile on the nanosecond time-scale as indicated by low order parameters for free GABARP. GABARAP anchored to nanodisc shows decreased internal mobility. The conformation changes of the N-terminal in the presence of a nanodisc were quantified by calculating differences of chemical shifts in three dimensions. Studying the dynamics of the membrane protein GABARAP anchored to nanodiscs is essential for the characterization of conformational changes on different time scales to achieve a complete picture of GABARAP interacting with a membrane and finally determine the role of this protein in autophagy. Another membrane protein, the 178-residue lipoprotein CD 1348, was found in the resistance machinery of gram-positive anaerobe bacterium Clostridium difficile. This bacterium has a strong line of defence against the innate immune system of the human host, such as cationic antimicrobial peptides (CAMPs), and against different antibiotics and lantibiotics. An operon encoding a three component ABC-transporter in C.difficile is characterized as a resistance system. Also, a two component system, which includes histidine kinase (HK) and a response regulator (RR), located on the same gene cluster might play an essential role in sensing to lantibiotics. Interestingly, lipoprotein CD 1348 is encoded directly in front of the CprABC transporter and can play an essential role in the resistance. Lipoprotein structure and its function are unknown. The second application is the determination of 3D structure of lipoprotein by solution NMR. Also, Small-angle X-ray scattering (SAXS) and theoretical calculations using the computation method “TopModel” were used independently to generate the lipoprotein structure. The assignment of the protein backbone side chains was made by the sequential backbone assignment using 3D 15N, 13C Transverse relaxation optimized spectroscopy (TROSY) NMR experiments. The calculation of the tertiary structure of proteins is one of the most important applications of NMR in structural biology. For this reason, the 3D structure calculation methods by solution NMR were performed here. The experimental 3D structure of the lipoprotein CD1348 was obtained from calculating interproton distances of NOE data from 3D 15N NOESY-TROSY experiments and one 4D 13C, 13C Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy (NOESY) HSQC experiment. Protein structure determines function, given that the specificity of active sites and binding sites depends on the precise three-dimensional conformation. Thus, resolving the protein structure is a considerable step forward for future analysis for each protein. In the current work, the possibility of binding lantibiotics with lipoprotein was analysed via titration experiments by measuring the chemical shifts of lipoprotein with different concentrations of lantibiotic gallidermin. The chemical shifts of some amino acids were observed in the presence of lantibiotic. The calculated structure of the lipoprotein is important for a better understanding of its role in the resistance machinery of the bacterium C. difficile against CAMP, antibiotics and lantibiotics. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät | |||||||
| Dokument erstellt am: | 31.01.2022 | |||||||
| Dateien geändert am: | 31.01.2022 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 24.08.2021 | |||||||
| Datum der Promotion: | 30.09.2021 |
