Dokument: In vitro analysis of the ABC transporter Pdr5

Titel:	In vitro analysis of the ABC transporter Pdr5
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=51938
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20200113-101544-8
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Wagner, Manuel [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 46,98 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 09.01.2020 / geändert 09.01.2020
Beitragende:	Prof. Dr. Schmitt, Lutz [Gutachter] Prof. Dr. Groth, Georg [Gutachter]
Stichwörter:	Promotion, Manuel Wagner, Biochemie, Dissertation
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 540 Chemie
Beschreibungen:	The overexpression of ATP-binding cassette (ABC) transporters is one of the main mechanisms that result in the phenomenon of multidrug resistance (MDR) existing across all organisms from man to bacteria. In Saccharomyces cerevisiae, the ABC transporters of the pleiotropic drug resistance (PDR) network are often involved in conferring MDR by lowering the cytosolic concentration of cytotoxic compounds. The key player of this network is Pdr5, a full-size ABC transporter that was discovered thirty years ago as a gene which’s gene product confers cycloheximide resistance. Since then it has become an important model to study MDR in fungi, especially since its homologues like Cdr1 from pathogenic Candida albicans are conferring resistance towards the most commonly clinically used antifungals. Mutational studies of Pdr5 mapped several key residues that are important for either its ATPase or transport activity. However, since it was not possible to investigate this efflux pump in an isolated form, many aspects of the molecular mechanism of the transport process remained elusive. Therefore, in a first step, a purification protocol was established that enabled in-depth biochemical, biophysical and structural analysis of Pdr5. It could be demonstrated that the detergent purified Pdr5 exhibits identical NTPase characteristics compared to Pdr5 located in the plasma membrane. Remarkably, using an electrophysiological approach, we could show that Pdr5 reconstituted into a planar lipid bilayer acts as a drug/proton symporter and can conduct ion currents. This has not been demonstrated for any other ABC exporter before. Pdr5 belongs to the class of asymmetric ABC transporters that possess a degenerate nucleotide binding site (NBS). Mutational studies demonstrated that this degeneration is of crucial importance for the functionality of the protein. Based on the established purification protocol it was possible to perform structural analysis of Pdr5 using single particle cryo electron microscopy (cryo-EM). During this doctoral research, we were able to obtain the first electron density maps and the resulting model structure of Pdr5 in its apo and occluded state. This allowed to propose a mechanistic model that explains how the degenerate NBS forms the structural basis for the transport process, which does not fully follow the classical ‘alternating access model’ but rather indicates a ‘twist-like’ conformational shift of Pdr5 during the substrate efflux. Finally, based on the biochemical and biophysical data combined with the proposed transport model, it can be concluded that cycloheximide, which initially led to the discovery of the ABC transporter Pdr5, might in fact not be a real substrate of Pdr5, but the observed cycloheximide-resistance is a byproduct of the proton pumping properties of Pdr5. Die Überexpression von ATP-binding cassette (ABC) Transportern ist einer der Hauptmechanismen, der in dem Phänomen der Multidrogenresistenz (MDR) resultiert und das in allen Organismen vom Menschen bis zur Bakterie existiert. In Saccharomyces cerevisiae sind die ABC Transporter des pleiotropen Drogenresistenz (PDR) Netzwerkes oft in die Vermittlung von MDR involviert, indem sie die zytosolische Konzentration zytotoxischer Stoffe reduzieren. Der Hauptakteur dieses Netzwerkes ist Pdr5, ein volllängen ABC Transporter, der vor dreißig Jahren als Gen entdeckt wurde, dessen Genprodukt Resistenz gegen Cycloheximid vermittelt. Seitdem ist es zu einem wichtigen Modell geworden, um MDR in Fungi zu untersuchen, vor allem, da seine Homologe wie Cdr1 von pathogenen Candida albicans Resistenz gegen die üblicherweise klinisch eingesetzten Fungizide vermitteln. Mutationsstudien mit Pdr5 haben mehrere Schlüssel-Aminosäuren aufgezeigt, die wichtig sind für entweder seine ATPase- oder Transportaktivität. Dennoch, da es nicht möglich war diese Effluxpumpe in isolierter Form zu studieren, blieben viele Aspekte des molekularen Mechanismus des Transportprozesses ungeklärt. Folglich wurde in einem ersten Schritt ein Protokoll zur Reinigung des Proteins etabliert, das die tiefgehende biochemische, biophysische und strukturelle Analyse von Pdr5 ermöglicht. Es konnte gezeigt werden, dass das Detergenz-gereinigte Pdr5 identische NTPase Eigenschaften aufweist wie Pdr5, das in der Plasmamembran lokalisiert ist. Bemerkenswerterweise konnten wir mit einem elektrophysiologischen Ansatz zeigen, dass Pdr5 rekonstituiert in eine planare Lipid-Doppelschicht als Drogen/Proton Symporter agiert und Ionenströme leiten kann. Dies wurde noch für keinen anderen ABC Exporter zuvor demonstriert. Pdr5 gehört zu der Klasse der asymmetrischen ABC Transporter, die eine degenerierte Nukleotidbindestelle (NBS) besitzen. Mutationsstudien zeigten, dass diese Degeneration von äußerster Wichtigkeit für die Funktionalität des Proteins ist. Basierend auf dem etablierten Protokoll für die Reinigung, war es möglich, Pdr5 strukturanalytisch mittels Einzelpartikel Kryoelektronenmikroskopie (cryo-EM) zu untersuchen. Während dieser Doktorarbeit konnten wir die ersten Elektronendichtekarten und die daraus resultierende Modellstruktur von Pdr5 in seiner apo und geschlossenen Form erhalten. Dies erlaubte ein mechanistisches Modell vorzuschlagen, das erklärt, wie die degenerierte NBS die strukturelle Basis für den Transportprozess bildet, welcher nicht vollständig dem klassischen „abwechselnden Zugangsmodell“ folgt, sondern eher auf eine drehungsähnliche Konformationsänderung von Pdr5 während des Substrateffluxes hindeutet. Abschließend, basierend auf den biochemischen und biophysischen Daten zusammen mit dem vorgeschlagenen Transportmodell, kann geschlussfolgert werden, dass Cycloheximid, welches initial zu der Entdeckung des ABC Transporters Pdr5 geführt hat, tatsächlich kein echtes Substrat von Pdr5 ist, sondern die beobachtete Cycloheximidresistenz ein Nebenprodukt der Eigenschaft Pdr5 ist, Protonen zu pumpen.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Chemie » Biochemie
Dokument erstellt am:	13.01.2020
Dateien geändert am:	13.01.2020
Promotionsantrag am:	08.10.2019
Datum der Promotion:	17.12.2019