Dokument: Combinatorial Biosynthesis of Natural and Non-natural Plant-derived Phenols in Microorganisms

Titel:	Combinatorial Biosynthesis of Natural and Non-natural Plant-derived Phenols in Microorganisms
Weiterer Titel:	Kombinatorische Biosynthese natürlicher und nicht-natürlicher pflanzlicher Phenole in Mikroorganismen
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=51179
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20191016-103523-6
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Aschenbrenner, Jennifer [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 46,00 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 08.10.2019 / geändert 08.10.2019
Beitragende:	Prof. Dr. Bott, Michael [Gutachter] Jun.-Prof. Dr. Axmann, Ilka M. [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Phenylpropanoids and phenylpropanoid-derived plant polyphenols have numerous applications in pharmaceutical and food industries and are used for example as antibiotics, therapeutics and colourants. Unfortunately, their extraction from plants is not efficient due to low product concentrations. In addition, downstream processing is impeded because the desired phenylpropanoids are present in a complex mixture of compounds with very similar chemical properties. These limitations can be overcome using microbial platform organisms to produce phenylpropanoids and polyphenols. The following results were obtained in this thesis: (1) The efficient production of monolignols is an important requirement for the synthesis of the pharmacologically relevant lignans, which belong to the class of plant polyphenols. An engineered Escherichia coli strain, equipped with a set of genes encoding enzymes for monolignol synthesis, was used to elucidate the microbial production of different monolignols. For this purpose, natural and non-natural phenylpropanoids were supplemented to respective biotransformations using the engineered strain to examine the promiscuity of heterologous enzymes. It was revealed that the engineered strain was able to catalyse the stepwise reduction of six naturally occurring phenylpropanoids including 5-hydroxyferulic acid and sinapic acid, which was reported for the first time. Additionally, chemically interesting non-natural phenylpropanoids, such as 3,4,5-trimethoxycinnamic acid, 5-bromoferulic acid, 3-nitroferulic acid, and a bicyclic p-coumaric acid derivative were also reduced to the corresponding non-natural monolignols. The microbial production of these compounds is a good basis for the synthesis of more complex plantderived compounds. (2) The site-specific and stereospecific decoration of phenylpropanoids with hydroxyl and O-methyl groups is a good possibility to obtain a variety of different phenylpropanoids. First a 4-coumarate 3-hydroxylase (C3H) from Saccharothrix espanaensis was used for the hydroxylation of p-coumaric acid yielding caffeic acid. In a second step, this enzyme was combined with the previously used monolignol pathway to produce caffeoyl alcohol from supplemented p-coumaric acid. Biotransformations resulted not only in caffeoyl alcohol production but also in pcoumaryl alcohol production. This underlined the challenges of selective product synthesis with promiscuous enzymes. Further substitutions at the phenyl ring were introduced with the caffeic acid O-methyltransferase (COMT) from Medicago sativa, which was engineered towards the methylation of caffeic acid and 5-hydroxyferulic acid in whole cell biotransformations with engineered E. coli strains. COMT libraries obtained from site-saturation mutagenesis at four positions were screened and selected strains were further characterised. Amino acid substitutions in four positions located in or adjacent to the methoxy binding pocket were shown to alter the substrate specificity towards caffeic acid and 5-hydroxyferulic acid to produce ferulic acid and sinapic acid, respectively. Variants were found with an increased productivity of up to 17 % for ferulic acid production and 46 % for sinapic acid production compared to the not engineered wild type E. coli strain. The results contribute to a better understanding of these enzymes and will help to perform metabolic engineering for the microbial production of more complex phenylpropanoid-derived compounds in the future. (3) The multicopper oxidase CueO from Rhodococcus erythropolis, previously used for the in vitro production of lignan, was now examined regarding lignan production using a respective recombinant E. coli strain. The gene cueO was expressed under the control of a T7 expression system and a pBAD expression system to find the best suited induction conditions. It was revealed that the tight gene regulation of the pBAD expression system can be used for the microbial lignan production. The strain was cultivated in the presence of coniferyl alcohol (1 mM) and produced 0.17 mM (+)-pinoresinol. This is the first time, that microbial (+)-pinoresinol production was observed. Phenylpropanoide und von ihnen abgeleitete pflanzliche Polyphenole haben zahlreiche Anwendungen in der Pharma- und Nahrungsmittelindustrie und werden beispielsweise als Antibiotika, Therapeutika und Farbstoffe eingesetzt. Leider ist ihre Extraktion aus Pflanzen ineffizient, da sie nur in geringen Konzentrationen vorkommen. Außerdem wird die Produktaufarbeitung dadurch erschwert, dass die gewünschten Phenylpropanoide im Pflanzengewebe in einem komplexen Stoffgemisch mit ähnlichen chemischen Eigenschaften vorkommen. Diese Einschränkungen können durch die Nutzung von mikrobiellen Plattformorganismen überwunden werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurden folgende Ergebnisse erzielt: (1) Die effiziente Monolignolproduktion ist eine wichtige Voraussetzung für die Synthese des pharmakologisch interessanten Lignans, welches ein pflanzliches Polyphenol ist. Ein genetisch veränderter Escherichia coli Stamm wurde mit Enzymen für die Monolignolproduktion ausgestattet, um die Möglichkeit der Produktion einer Vielzahl von unterschiedlichen Monolignolen zu untersuchen. Dafür wurden natürliche und nicht-natürliche Phenylpropanoide zu Biotransformationen hinzugegeben und die Promiskuität der Enzyme erforscht. Es konnte gezeigt werden, dass der genutzte Stamm die schrittweise Reduktion von sechs natürlichen Phenylpropanoide katalysiert, darunter auch die Reduktion von 5-Hydroxyferulasäure und Sinapinsäure, welches zum ersten Mal beschrieben werden konnte. Die chemisch interessanten nicht-natürlichen Phenylpropanoide 3,4,5-Trimethoxyzimtsäure, 5-Bromferulasäure, 3- Nitroferulasäure und ein bizyklisches p-Coumarsäurederivat wurden ebenfalls zum entsprechenden Monolignol reduziert. Die mikrobielle Produktion dieser Stoffe ist eine gute Basis für die Synthese von komplexeren pflanzlichen Substanzen. (2) Die Dekoration von Phenylpropanoiden mit Hydroxy- und O-Methylgruppen ist eine gute Möglichkeit, um eine Vielzahl verschiedener Phenylpropanoide zu erhalten. Zunächst wurde eine 4-Cumarat-3-Hydroxylase (C3H) von Saccharothrix espanaensis für die Hydroxylierung von p-Cumarsäure zu Kaffeesäure verwendet. In einem zweiten Schritt wurde dieses Enzym mit dem zuvor verwendeten Monolignolsyntheseweg kombiniert, um Kaffeoylalkohol aus hinzugefügter pCumarsäure herzustellen. Biotransformationen führten nicht nur zur Produktion von Kaffeoylalkohol, sondern auch zur Produktion von p-Cumarylalkohol. Dies unterstreicht die Herausforderungen der selektiven Produktsynthese mit promiskuitiven Enzymen. Weitere Substitutionen am Phenylring wurden mit einer Kaffeesäure O-Methyltransferase (COMT) aus Medicago sativa eingefügt. Diese wurde gentechnisch verändert, um die Methylierung von Kaffeesäure und 5-Hydroxyferulasäure in Ganzzellbiotransformationen mit E. coli zu steigern, wodurch Ferulasäure bzw. Sinapinsäure entsteht. Durch ortsspezifische Sättigungsmutagenese an vier Positionen wurde eine COMT Bibliothek erstellt, anschließend durchmustert und ausgewählte Varianten charakterisiert. Es konnte gezeigt werden, dass Aminosäuresubstitutionen in den Position 135, 136, 162 und 172, die in der Methoxybindetasche oder in deren Nähe lokalisiert sind, die Substratspezifität verändert. Außerdem konnte die Produktivität im Vergleich zur Wildtypvariante um 17 % für die Ferulasäureproduktion bzw. um 46 % für die Sinapinsäureproduktion gesteigert werden. Die erhaltenen Varianten können zu einem besseren Verständnis dieser Enzyme beitragen und eine gentechnische Veränderung von Organismen für die Produktion von komplexen Phenylpropanoid-Verbindungen erleichtern. (3) Die Multikupferoxidase CueO aus Rhodococcus erythropolis wurde bisher für die in vitro Lignanproduktion genutzt und wurde nun hinsichtlich der Verwendung in E. coli untersucht. Das Gen cueO wurde unter der Kontrolle des T7- Expressionssystems und des pBAD-Expressionssystems exprimiert, um die am besten geeigneten Induktionsbedingungen zu finden. Es zeigt sich, dass die enge Genregulation durch das pBAD-Expressionssystem für die mikrobielle Lignanproduktion verwendet werden kann. Der konstruierte Produktionsstamm wurde in Gegenwart von 1 mM Coniferylalkohol kultiviert und die Konzentration des Lignans (+)-Pinoresinol wurde bestimmt. Am Ende der Biotransformation wurden unter Verwendung dieses Enzyms in vivo 0.17 mM (+)-Pinoresinol hergestellt. Dies ist das erste Mal, dass die Produktion von mikrobiellem (+)-Pinoresinol beobachtet wurde.
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Fachbereich / Einrichtung:	Sonstige Einrichtungen/Externe » Institute in Zusammenarbeit mit der Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf » Institut für Biotechnologie, Forschungszentrum Jülich GmbH
Dokument erstellt am:	16.10.2019
Dateien geändert am:	16.10.2019
Promotionsantrag am:	25.01.2019
Datum der Promotion:	20.05.2019