Dokument: Mechanisms of therapy resistance in adrenocortical carcinoma

Titel:	Mechanisms of therapy resistance in adrenocortical carcinoma
Weiterer Titel:	Mechanismen der Therapieresistenz im Nebennierenrindenkarzinom
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=48198
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20190114-110736-9
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Seidel, Eric [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 3,60 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 05.01.2019 / geändert 05.01.2019
Beitragende:	Prof. Dr. Scholl, Ute [Gutachter] Prof. Dr. Fahlke, Christoph [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 540 Chemie
Beschreibungen:	Adrenocortical Carcinoma (ACC) is a rare and aggressive malignancy of the adrenal cortex characterized by fast progression and dismal prognosis. It commonly features excessive production of steroid hormones leading to Cushing’s syndrome, virilization, feminization and, in rare cases, Conn’s syndrome. Adrenocortical carcinoma mostly develops sporadically between the fourth and fifth decade of life. The only curative treatment known to date is the complete surgical resection of the tumor. However, recurrence after resection is reported in 40-60% of the patients. Mitotane is the only drug approved for ACC treatment. Its major mode of action is the inhibition of sterol-o-acyl transferase (a major regulator of intracellular free cholesterol) leading to accumulation of free cholesterol, endoplasmic reticulum stress and apoptosis. It is commonly used in combination with etoposide, doxorubicin and cisplatin in advanced or metastatic ACC and as adjuvant treatment after resection. The use of mitotane may prolong recurrence free survival but does not affect overall survival. Moreover, patients commonly do not respond or face recurrence during mitotane therapy, even when therapeutic blood levels are maintained. These observations suggest a mechanism of ac¬quired resistance towards mitotane in ACC. The underlying mechanisms, however, have not been investigated. The present thesis therefore investigates the mechanisms underlying mitotane resistance in an in vitro model of mitotane resistant ACC. Mitotane resistant clonal cell lines were established from long-term treated HAC-15 cells, and were subsequently characterized by in vitro studies, a gene expression microarray study with subsequent Gene Ontology enrichment analysis and a whole exome sequencing study. Finally, selected driver pathway candidates were investigated in vitro and intracellular content of several lipid species and mitotane was assessed by ESI-MS/MS and GCMS, respectively. Mitotane resistance in the present in vitro model was not accompanied by doxorubicin resistance, and upregulation of the gene expression of common multidrug resistance transporters MDR1, MRP1 and BCRP was excluded in the microarray study. Further, the IC50 of mitotane was found to be positively correlated with medium content of HDL, LDL and cholesterol. Moreover, mitotane resistance was mitigated at low medium lev¬els of HDL and LDL. Gene Ontology enrichment analysis demonstrated upregulation of pathways involved in Wnt signaling and cell growth and downregulation of pathways involved in biosynthesis and metabolism of steroid hormones, lipid transport as well as lipoprotein binding and clearance in resistant cells. Exome sequencing revealed high genetic similarity among mitotane resistant clonal cell lines. Investigation of candidates ( SCARB1, AGTR1, Wnt and DDIT4L/mTor) did not lead to identification of singular driver genes or pathways. Investigation of intracellular lipid content revealed resistant cells to be depleted of cholesteryl esters. Treatment with 50 µM mitotane caused a significant increase in intracellular free cholesterol, the major mediator of mitotane associated cytotoxic effects, as well as proapoptotic ceramides and lysophosphatidylcholines in nonresistant, but not in resistant cells. Also, sphingomyelins were significantly increased in nonresistant cells in comparison to resistant cells at all conditions, and treatment with 50 µM mitotane caused a significant increase in sphingomyelins in non¬resistant, but not in resistant cells. Mitotane resistant cells showed a tendency towards reduced intracellular mitotane content, however no significant effect was found. The data provided in the present thesis suggest that mitotane resistance in the present in vitro model is different from common multidrug resistance. According to the whole exome sequencing study, mitotane resistant clonal cell lines may derive from a single, mitotane resistant cell. In vitro experiments and the gene expression microarray study suggest a role of medium lipoprotein content and lipoprotein uptake in mitotane resistance in the present in vitro model. Discovery of the downregulation of genes implicated in pathways connected to metabolism and biosynthesis of steroid hormones may help explain the reduction of steroid hormone excess commonly observed in mitotane treated patients. Absence of mitotane dependent increase in intracellular free cholesterol suggests impaired sterol-o-acyltransferase inhibition in resistant cells. Das Nebennierenrindenkarzinom (engl.: adrenocortical carcinoma; ACC) ist eine seltene Tumorerkrankung der Nebennieren, die durch eine rasche Progression und eine schlechte Prognose gekennzeichnet ist. Dabei kommt es aufgrund einer Überproduktion an Steroidhormonen häufig zur Entstehung eines Cushing Syndroms, einer Überproduktion an Geschlechtshormonen und seltener eines Conn Syndromes. Das ACC entwickelt sich häufig sporadisch im Alter von 40-50 Jahren und kann momentan nur durch eine vollständige, chirurgische Entfernung des Tumors geheilt werden. Allerdings kommt es in 40-60% der Patienten zu Rezidiven. Mitotan ist momentan das einzige Medikament, das zur Behandlung des ACC zugelassen ist. Mitotan wirkt haupt¬sächlich, indem es das Enzym Sterol-o-acyltransferase, den wichtigsten Regulator von intrazellulären Cholesterinspiegeln, hemmt. Dies führt zu intrazellulären Cholesterinablagerungen, endoplasmatischem Retikulum Stress und Apoptose. Mitotan wird in der adjuvanten Therapie nach Operation und zur Behandlung von fortgeschrittenem und metastasiertem ACC eingesetzt, meist als Kombinationspräparat mit Doxorubicin, Etoposid und Cisplatin. Mitotan kann das rezidivfreie Überleben verbessern, scheint das Gesamtüberleben aber nicht zu beeinflussen. Darüber hinaus kommt es auch häufig unter therapeutisch wirksamen Blutspiegeln von Mitotan zu Rezidiven und Nonrespondern. Diese Beobachtungen legen nah, dass es unter Mitotantherapie zu einer erworbenen Resistenz kommt, die bislang noch nicht näher untersucht wurde. Ziel der vorliegenden Doktorarbeit war es daher, die der Mitotanresistenz zugrunde liegenden Mechanismen anhand eines geeigneten in vitro Modells näher zu untersuchen. Dazu wurden mitotanresistente, klonale Zelllinien aus langzeitbehandelten HAC-15 Zellen isoliert. Die resistenten Zelllinien wurden daraufhin anhand von in vitro Studien, einem Genexpressionsmicroarray und mittels Exomsequenzierung charakterisiert. Daraufhin wurden ausgewählte Kandidaten und Signalwege auf ihre Rolle als Driver hin untersucht. Des Weiteren wurde der intrazelluläre Gehalt von Mitotan und diversen Lipiden mittels Massenspektrometrie bestimmt. Im vorliegenden in vitro Modell der Mitotanresistenz wurde keine Resistenz gegen Doxorubicin festgestellt. Auch wurde im Genexpressionsarray keine Veränderung der Genexpression der wichtigsten Multiresistenzgene MDR1, MRP1 und BCRP festgestellt. Es wurde eine positive Korrelation zwischen der Konzentration an HDL, LDL und Cholesterin im Medium und der IC50 von Mitotan gefunden. Darüber hinaus war die Mitotanresistenz in Anwesenheit von geringen Lipoproteinkonzentration im Medium abgeschwächt. Eine Gene Ontology Enrichment Analyse identifizierte hochregulierte Signalwege mit einer Rolle in der Wnt Signalkaskade und dem Zellwachstum und runterregulierte Signalwege mit einer Rolle in der Biosynthese und dem Abbau von Steroidhormonen und Lipiden und in der Bindung und Clearance von Lipoproteinen in resistenten Zellen. In Untersuchungen von SCARB1, AGTR1, Wnt and DDIT4L/mTor als Kandidaten konnten keine singulären Driver der Resistenz identifiziert werden. Resistente Zellen wiesen einen signifikant stark verringerten Gehalt an Cholesterinestern auf. Der intrazelluläre Gehalt an freiem Cholesterin, dem hauptsächlichen Verursacher der Mitotan vermittelten Cytotoxizität, und an proapoptotischen Lysophosphatidylcholinen und Ceramiden war in nichtresistenten, mit 50 µM Mitotan behandelten Zellen signifikant erhöht, nicht aber in resistenten Zellen. Sphingomyeline waren in resistenten Zellen unter allen getesteten Bedingungen signifikant erniedrigt. Darüber hinaus führte eine Behandlung mit 50 µM Mitotan zu einer signifikanten Erhöhung von Sphingomyelinen in nichtresistenten, nicht aber in resistenten Zellen. Der intrazelluläre Mitotangehalt in resistenten Zellen war tendenziell niedriger als in nichtresistenten Zel¬len, allerdings wurde kein signifikanter Effekt festgestellt. Die im Rahmen der vorliegenden Doktorarbeit erhobenen Daten legen die Schlussfolgerung nahe, dass sich die Mitotanresistenz in vorliegendem in vitro Model von der häufig beobachteten Multidrug-Resistenz unterscheidet. Die verringerte Expression von Genen, die eine Rolle in Biosynthese und Abbau von Steroidhormonen spielen, könnte einen Erklärungsansatz für die oft beobachtete Linderung der durch Steroidhormone verursachten Symptome in Mitotan behandelten ACC Patienten liefern. Die Resultate der Exomsequenzierungsstudie deuten darauf hin, dass alle resistenten Zelllinie von einer gemeinsamen Vorläuferzelle abstammen. Die durchgeführten in vitro Studien weisen, zusammen mit der Genexpressionsstudie, auf eine bedeutende Rolle des Lipoproteingehaltes des Medium und der Lipoproteinaufnahme im vorliegenden in vitro Modell hin. Das Ausbleiben einer Erhöhung des intrazellulären freien Cholesterins unter Mitotanbehandlung in resistenten Zellen deutet auf eine Störung der Inhibition der Sterol-o-acyltransferase durch Mitotan hin.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät
Dokument erstellt am:	14.01.2019
Dateien geändert am:	14.01.2019
Promotionsantrag am:	28.06.2018
Datum der Promotion:	26.09.2018