Dokument: Solid-State NMR and DNP-Enhanced NMR Studies on Intrinsically Disordered Proteins

Titel:	Solid-State NMR and DNP-Enhanced NMR Studies on Intrinsically Disordered Proteins
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=46679
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20180810-102306-0
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Uluca, Boran [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 19,97 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 03.08.2018 / geändert 03.08.2018
Beitragende:	Prof. Dr. Heise, Henrike [Gutachter] Dr. Etzkorn, Manuel [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	α-Synuclein (α-syn), bestehend aus 140 Aminosäureresten, gehört zur Familie der intrinsisch ungeordneten Proteine (IDPs). Dies bedeutet, dass es keine wohl definierte native Konformation aufweist, sondern dynamisch eine Vielzahl von transienten Konformationen besitzt. Die Funktion von α-Synuclein ist noch nicht gänzlich aufgeklärt. Es ist jedoch bekannt, dass ein Großteil des Proteins an Membranen der präsynaptischen Nervenenden bindet, und man vermutet, dass die Funktion mit der Bindung an diese Membranen zusammenhängt. Zudem ist bekannt, dass die Aggregation von α-Synuclein mit der Parkinson-Krankheit korreliert. Aus diesem Grund habe ich das Konformationen-Ensemble von α-Synuclein in verschiedenen Zuständen des Proteins, d.h. in nativer, fibrillärer und in Membran-gebundener Form, untersucht. In der vorliegenden Dissertation wurden NMR Experimente an α-Synuclein in gefrorener Lösung in Kombination mit Hyperpolarisation (DNP) durchgeführt, um die inhärent geringe Sensitivität der Festkörper-NMR-Spektroskopie zu umgehen. Das Einfrieren der heterogenen Konformationen von IDPs führt zu inhomogener Linienverbreiterung. Obwohl dies häufig als ungewollter Nebeneffekt der DNP-NMR-Spektroskopie angesehen wird, enthalten die verbreiterten Linien wertvolle Informationen über das Konformationsensemble. Die Zusammensetzung der Konformationen wurde anhand der inhomogen verbreiterten Linien für jeden der drei oben genannten Zustände des Proteins untersucht. Mit Hilfe der sparse isotopen Markierungsstrategie wurden nur gewünschte Aminosäuren in der Sequenz markiert und somit die Überlappung der Signale in den Spektren reduziert. Aufgrund der empirischen Korrelation zwischen den chemischen Verschiebungen und der Konformation des Proteinrückgrates konnten die Sekundärstrukturelemente des Proteins ermittelt werden. Die erhaltenen Daten für monomeres α-Synuclein sind in guter Übereinstimmung mit früheren Konformationsstudien anhand von NMR und SAXS. In diesen Studien zeigte das Proteinrückgrat in der ungeordneten Form 30 % α-helikale und 70 % β-Faltblatt-typische Anteile. Monomeres α-syn gilt als vollständig ungeordnet, somit konnte die Anzahl der Reste geschätzt werden, die in fibrillärem und Membran-gebundenem Protein eine keine geordnete Struktur aufweisen. Im ersten Teil der Dissertation wurde also gezeigt, dass DNP-Festkörper-NMR-Spektroskopie eine leistungsstarke Methode zur Untersuchung der Konformation von Proteinen ist, die nicht zugänglich für Lösung-NMR-Spektroskopie sind. [PSI +] ist eine Prionenform des Sup35-Proteins, welches eine Untereinheit des Translationsterminationsfaktors ist. Die Bildung der Prionform von Sup35 führt zu einem vermehrten Überlesen des Stopcodons. Trotz des großen Forschungsinteresses an Sup35NM (N und M Domäne), herrscht noch kein Konsens über die Struktur der Moleküle in der Fibrille. Eine einzige Punktmutation in der Sup35NM Aminosäuresequenz ändert den Amyloid-Kernbereich bedeutend. Im zweiten Teil dieser Dissertation haben wir die Amyloidkernbereiche in Fibrillen der Wildtyp-Form sowie von der S17R-Mutante von Sup35NM über Abstandsmessungen zwischen selektiv eingeführten 13C-Isotopenmarkierungen mit Hilfe von Festkörper-NMR-Spektroskopie bestimmt. Zusammenfassend konnten wir besttätigen, dass verschiedene Bereiche des Proteins in der S17R Mutante und der Wildtyp-Form an der Fibrillenbildung beteiligt sind. The 140 amino acid residue α-synuclein (α-syn) belongs to the family of intrinsically disordered proteins (IDPs). Thus, its native state does not adopt a well-defined single molecular structure but exists as a highly dynamic and heterogeneous ensemble of different conformers. While the exact function of the protein is not well understood, a considerable portion of α-syn can bind to the membrane in presynaptic terminals and is supposed to be associated with membrane structures at synaptic terminals. Additionally, its abnormal aggregation is associated with Parkinson’s disease. Hence, we have studied conformational ensembles of α-syn in different states of the protein, i.e. the fully disordered form, the fibrillar form, and the membrane-bound state. In this thesis, the combination in frozen solution NMR experiments with Dynamic Nuclear Polarization (DNP) has been used to overcome the inherently low sensitivity of solid-state NMR (ssNMR). Freezing the high conformational heterogeneity of IDPs at low temperature causes inhomogeneous line-broadening. While this is mostly accounted for as an unwanted side-effect of DNP-NMR, heterogeneous line-broadening contains valuable information about conformational ensembles of (disordered) proteins. We have explored the conformational ensemble of α-syn in the three states mentioned above from inhomogeneously broadened lines. Sparse labeling has enabled us to only label backbone atoms of the selected residue and reduce spectral overlap in the NMR spectra. As there is an empirical correlation between the protein backbone conformation and chemical shifts, we could exploit the secondary structure propensities of the protein. Our data on the monomeric form of α-syn in frozen solution is largely in line with conformational propensities of α-syn derived from NMR, SAXS and MD results, in which random-coil valine residues roughly sampled 70% β-sheet-like and 30% α-helical conformation. Utilizing this results, we could also estimate the secondary structure elements in fibrillar α-syn and test membrane binding of α-syn under different conditions. Overall, in the first part of this thesis, we demonstrate that the DNP-enhanced NMR is a useful and powerful tool to study conformational ensemble of disordered proteins that are not accessible to solution NMR. The [PSI +] is a prion form of the Sup35 protein which is a subunit of the translation termination factor in yeast. The prion formation of Sup35 leads to read-through of stop codons, causing non-sense suppression. Despite the high interest on Sup35NM (N-domain together with the M-domain), there is no consensus on the organization of monomers within Sup35NM fibrils. One single point mutation in the Sup35NM sequence dramatically altered the amyloid core region. In the second part of this work, we have successfully determined the amyloid core region in fibrils of wild type as well as the S17R mutant of Sup35NM via distance measurements between the selectively 13C labeled sites by ssNMR spectroscopy. In conclusion, our ssNMR results showed that different regions of the protein for wild type and the S17R mutant of Sup35NM are involved in the amyloid core region.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät
Dokument erstellt am:	10.08.2018
Dateien geändert am:	10.08.2018
Promotionsantrag am:	03.08.2017
Datum der Promotion:	18.08.2017