Dokument: eNOS derived oxidative stress and its role in the regulation of blood pressure

Titel:	eNOS derived oxidative stress and its role in the regulation of blood pressure
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=46340
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20180703-104046-2
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Dr. Pick, Stephanie [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 6,94 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 26.06.2018 / geändert 26.06.2018
Beitragende:	Prof. Dr. Kojda, Georg [Gutachter] Prof. Dr. Kassack, Matthias U. [Gutachter]
Stichwörter:	eNOS, oxidative stress, blood pressure
Dewey Dezimal-Klassifikation:	600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften » 610 Medizin und Gesundheit
Beschreibungen:	Hintergrund: Essentielle Hypertonie steht in Zusammenhang mit endothelialer Dysfunktion und reaktive Sauerstoffverbindungen scheinen dabei eine Rolle zu spielen. Inwiefern endotheliales Superoxid-Radikal-Anion (O2-•) im Frühstadium der Entwicklung einer Hypertonie eine Rolle spielt, ist bisher nicht bekannt. In dieser Studie wird untersucht, ob durch endotheliale Stickstoffmonoxid Synthase (eNOS) im Endothel vermittelter oxidativer Stress an der Regulation des systolischen Blutdrucks beteiligt ist. Methoden: Um zu untersuchen, ob dysfunktionale vaskuläre eNOS an der Regulation des Blutdrucks beteiligt sein könnte, werden zwei verschiedene eNOS Varianten endothelspezifisch mittels des Tie-2 Promotors überexprimiert. Wildtyp eNOS [Mäuse mit einer endothelspezifischen Überexpression boviner eNOS (eNOS-tg)] oder ebenso eine neue dimerdestabilisierte eNOS Mutante mit einem teilweise zerstörten Zinkfinger [Mäuse mit endothelspezifischer Überexpression destabilisierter boviner eNOS (C101A-eNOS-tg)] wird im Gefäßsystem von C57BL/6-Mäusen exprimiert. Die Destabilisierung der eNOS wird durch einen Austausch von Cystein 101 durch Alanin erreicht, was in einer verminderten eNOS Dimerstabilität, vermehrter O2-• und verringerten Stickstoffmonoxid (NO) Bioverfügbarkeit in stabil transfizierten humanen embryonalen Nierenzellen 293 (HEK 293) führt. Die mutierten Mäuse werden auf endothelabhängige Aortenrelaxation, systolischen Blutdruck, O2-• Konzentration und verschiedene posttranslationale Modifikationen, die auf Aktivität und/oder erhöhten vaskulären oxidativen Stress hindeuten, untersucht. Einige Gruppen von Mäusen werden freiwilligem körperlichen Training oder einer Behandlung mit dem Superoxiddismutasemimetikum Tempol® unterzogen. Ergebnisse: Westernblot Untersuchungen in Aorten-, linksventrikulärem Myokard-, Lungen- und Skelettmuskelgewebe belegen die vaskulär spezifische eNOS Überexpression in C101A-eNOS-tg und eNOS-tg. O2-• Level sind in C101A-eNOS-tg, allerdings nicht in eNOS-tg, erhöht und dies kann durch Inkubation mit dem Stickstoffmonoxid Synthase (NOS)-Inhibitor Nitro-L-arginin maskiert werden, was ein Hinweis dafür ist, dass die destabilisierte eNOS als eine Quelle für O2-• fungiert. Ebenso sind Peroxynitritkonzentrationen, gemessen durch Protein-Tyrosin-Nitrierung und eNOS-Tyrosin-Nitrierung, in C101A-eNOS-tg erhöht, allerdings unverändert in eNOS-tg. Die Proteinkinase G Aktivität, evaluiert durch Phosphorylierung an vasoaktiv stimuliertem Protein (VASP) an Ser239, ist in beiden Linien im Vergleich zu Kontrollen unverändert, was auf eine normale Aktivierung des NO/cGMP-Signaltransduktionswegs hindeutet. Organbadexperimente zeigen eine normale Aortenreaktivität auf Acetylcholin, Phenylephrin und den NO-Donor SNAP in beiden Tierlinien. In C101A-eNOS-tg kann signifikant verstärkte eNOS-S-Glutathionylierung, eNOS-Ser1177/9-Phosphorylierung und Adenosinmonophosphatkinase (AMPK)α Phosphorylierung an Thr172 in Aorta, Skelettmuskel, linksventrikulärem Myokard und Lunge im Vergleich zu eNOS-tg und Wildtypkontrollen gezeigt werden. Körperliches Training verstärkt die Phosphorylierung der eNOS an Ser1177/9 und AMPKα in Wildtyptieren. Diese physiologischen Adaptionen können in C101A-eNOS-tg nicht beobachtet werden. C101A-eNOS-tg zeigen sich, gemessen an wachen Tieren durch die Tail-Cuff Methode, trotz einer eNOS Überexpression systolisch normoton, eNOS-tg signifikant hypoton. Das Antioxidans Tempol® kann die auftretenden Proteinmodifikationen vollständig aufheben und reduziert signifikant den systolischen Blutdruck in C101A-eNOS-tg, nicht aber in Wildtyptieren. Schlussfolgerung: Oxidativer Stress durch endothelspezifische Überexpression genetisch destabilisierter C101A-eNOS verhindert selektiv die blutdruckvermindernde Wirkung vaskulärer eNOS, wohingegen kein Effekt auf endothelabhängige Relaxation in der Aorta besteht. Diese Daten weisen darauf hin, dass eine verringerte eNOS Dimerstabilität, die mit vaskulärem oxidativen Stress im mikrovaskulären Endothel im Zusammenhang steht, direkt an der Regulation des Blutdrucks beteiligt sein und somit bei der Entstehung der essentiellen Hypertonie eine Rolle spielen könnte. Objectives: Essential hypertension is associated with endothelial dysfunction and reactive oxygen species are considered to play a role here. But whether endothelial superoxide anion radical (O2-•) may play a role in the early development of hypertension remains uncertain. The aim of this study is to investigate whether endothelial nitric oxide synthase (eNOS)-derived endothelial oxidative stress is involved in the regulation of systolic blood pressure. Methods: In order to investigate whether dysfunctional vascular eNOS might contribute to the regulation of blood pressure, two different eNOS variants are overexpressed by the endothelial specific tie-2 promoter. Wild-type eNOS [mice with endothelium-specific overexpression of bovine eNOS (eNOS-tg)] or respectively a novel dimer-destabilized eNOS-mutant harboring a partially disrupted zinc-finger [mice with endothelium-specific overexpression of destabilized bovine eNOS (C101A-eNOS-tg)] was introduced in the vasculature of C57BL/6 mice. Destabilization of eNOS was induced via replacement of cysteine 101 residue by alanine, resulting in impaired eNOS dimer stability, increased O2-•, and decreased nitric oxide (NO) bioavailability in stably transfected human embryonic kidney cells 293 (HEK 293). Mutant mice are monitored for aortic endothelium-dependent relaxation, systolic blood pressure, levels of O2-•, and several posttranslational modifications indicating activity and/or increased vascular oxidative stress. Some groups of mice underwent voluntary exercise training for four weeks or treatment with the superoxide dismutase mimetic Tempol®. Results: Western blot analysis in aortic, left ventricular myocardium, lung, and skeletal muscle tissue proves the vascular-specific overexpression of eNOS in C101A-eNOS-tg and eNOS-tg. O2-• levels are increased in C101A-eNOS-tg but not in eNOS-tg; and this elevation is blunted by incubation with the nitric oxide synthase (NOS) inhibitor L-nitroarginine suggesting destabilized eNOS to be a source of O2-•. Likewise, peroxynitrite levels measured by protein-tyrosine-nitration and eNOS-tyrosine-nitration are increased in C101A-eNOS-tg but unchanged in eNOS-tg. Protein kinase G activity is evaluated by vasoactive stimulated protein (VASP) phosphorylation at Ser239, showing no difference in both strains vs. controls, indicating a normal NO/cGMP-pathway activation. Organ bath experiments reveal normal aortic reactivity to acetylcholine, phenylephrine, and NO-donor S-nitroso-N-acetyl-D,L-penicillamine (SNAP) in both animal strains. C101A-eNOS-tg show significantly increased eNOS-S-glutathionylation, eNOS1176/9 phosphorylation and adenosine monophosphate activated protein kinase (AMPK)α phosphorylation at Thr172 in the aorta, skeletal muscle, left ventricular myocardium, and lung as compared to eNOS-tg and wild-type controls. Exercise training increases the phosphorylation of eNOS at Ser1176/9 and AMPKα in wild-types. These physiological adaptations are absent in C101A-eNOS-tg. C101A-eNOS-tg displayes normal systolic blood pressure (measured in awake mice by tail-cuff method) despite higher levels of eNOS, whereas eNOS-tg shows significant hypotension. The antioxidant Tempol® completely reverses the occurring protein modifications and significantly reduces systolic blood pressure in C101A-eNOS-tg but not in wild-types. Conclusion: Oxidative stress generated by endothelial-specific expression of genetically destabilized C101A-eNOS selectively prevents the systolic blood pressure-reducing activity of vascular eNOS, while having no effect on aortic endothelium-dependent relaxation. These data suggest that a decrease of eNOS dimer stability associated with increased vascular oxidative stress in the microvascular endothelium might directly contribute to the regulation of blood pressure and may play a role in the development of essential hypertension.
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Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Pharmazie Medizinische Fakultät » Institute » Institut für Pharmakologie und Klinische Pharmakologie
Dokument erstellt am:	03.07.2018
Dateien geändert am:	03.07.2018
Promotionsantrag am:	09.04.2018
Datum der Promotion:	25.06.2018