Dokument: Enrichment, isolation and molecular characterization of circulating tumour cells for treatment optimization in metastatic breast cancer

Titel:	Enrichment, isolation and molecular characterization of circulating tumour cells for treatment optimization in metastatic breast cancer
Weiterer Titel:	Anreicherung, Isolierung und molekulare Charakterisierung von zirkulierenden Tumorzellen für Therapie-Optimierung im metastasierten Mammakarzinom
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=45947
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20180511-124051-5
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Lampignano, Rita [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 6,97 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 10.05.2018 / geändert 10.05.2018
Beitragende:	Prof. Dr. rer. nat. Neubauer, Hans [Betreuer/Doktorvater] Prof. Dr. Urlacher, Vlada B. [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Circulating tumour cells (CTCs) have been observed in the peripheral blood of cancer patients and their abundance has been correlated to poor clinical outcomes in metastatic breast cancer (mBC). CTCs are mostly enriched by EpCAM-based systems (e.g. CellSearch®) which overlook EpCAM-low/negative tumour cells with an epithelial/mesenchymal plasticity, postulated to be highly aggressive. Main goal of this project was to establish robust workflows to enrich, detect, isolate and characterize patient-matched EpCAM-high and EpCAM-low/negative CTCs in blood as well as in leukapheresis (DLA) samples of metastatic breast cancer patients. The first enrichment-detection workflow combines the CellSearch® and VyCAP™ filtration systems and it was applied to a cohort of 14 blood samples and 8 DLA samples. In the second workflow, single CTC isolation was incorporated by combining the CellSearch®, the Parsortix™ and the CellCelector™ micromalipulation systems. This workflow was applied to a cohort of 52 mBC blood samples. Afterwards, isolated cells were characterized according to the third workflow: CTCs were processed for whole genome amplification (WGA) and sequenced for PIK3CA hotspot mutations through an amplicon-based approach. By virtue of the first workflow, both EpCAM-high and EpCAM-low/negative CTCs could be observed in 78 % of blood samples and in 50 % of DLA samples, without any correlation in positivity rates. With the second workflow, both CTC-subpopulations could be detected in 56 % of processed blood samples, confirming the lack of linearity in frequencies. High integrity WGA products were observed in 7% of isolated EpCAM-low/negative cells vs. 28% of patient-matched EpCAM-high cells, suggesting increased apoptosis within the first CTC-fraction. CTCs harbouring PIK3CA hotspot mutations were detected in 4/10 patients´ blood samples. One patient carried the E545K mutation in EpCAMlow/negative CTCs only and two patients showed H1047L and H1047R mutations within EpCAM-high CTCs only. The fourth patient showed hotspot mutations in both CTC-subgroups: the E545K mutation in one EpCAM-low/negative CTC and the H1047L mutation in two EpCAM-high CTCs. In summary, three robust workflows were successfully established and they respectively allow to enrich, isolate, and analyse patient-matched EpCAM-high and EpCAM-low/negative CTCs in metastatic breast cancer. For the first time, the heterogeneous PIK3CA mutational status has been observed within EpCAM-low/negative CTCs with regards to patient-matched EpCAM-high cells. In future experiments, patient cohorts will be increased and follow up data will be related to the frequency of EpCAM-low/negative CTCs as well as to the presence of PIK3CA hotspot mutations to shed light on this subgroup of CTCs and to better investigate the potential role of the PIK3CA oncogene as treatment resistance biomarker. Zirkulierende Tumorzellen (CTCs) können im peripheren Blut von Krebspatienten identifiziert werden und in verschiedenen Tumor-Entitäten korreliert ein erhöhtes Vorkommen von CTCs mit schlechterer Prognose. Die meisten Technologien zur Anreicherung von CTCs basieren auf dem epithelialen Marker EpCAM (CellSearch®), was jedoch zur Folge hat, dass Zellen, die sich in der epithelialen/mesechymalen Transition befinden und potenziell sehr aggressiv sind, übersehen werden können. Ziel dieser Arbeit war daher die Etablierung eines stabilen Arbeitsablaufs für die gleichzeitige Anreichung, Detektion, Isolierung und Charakterisierung von sowohl EpCAMpositiven als auch „EpCAM-niedrig/negativen“ CTCs aus Blut- und Apheresat-Proben (DLA) von Patientinnen mit einem metastasierten Mammakarzinom. Die erste in dieser Arbeit etablierte Anreichungs- und Detektionsmethode kombiniert die Systeme CellSearch® und VyCAP™. Sie wurde zur Anreicherung von CTCs aus 14 Blut- und 8 Apheresat-Proben von Mammakarzinom Patientinnen angewendet. Die zweite etablierte Methode zur Isolierung von CTCs umfasst die Systeme CellSearch®, Parsortix™ und CellCelector™. Mittels dieses Arbeitsablaufs wurden Blutproben von 52 Patientinnen analysiert. Die isolierten Zellen wurden im Anschluss mit einer dritten in dieser Arbeit etablierten Methode charakterisiert: zu diesem Zweck wurde die DNA der Zellen extrahiert, amplifiziert und mittels einer amplicon-basierten Methode sequenziert, um „Hot-spot“ Mutationen des Onkogens PIK3CA zu detektieren. Mit Hilfe der ersten Anreicherungsmethode konnten sowohl EpCAM-hohe als auch EpCAM-niedrig/negative CTCs in 78 % der Blutproben und in 50 % der Apheresat-Proben identifiziert werden, jedoch konnte keine positive Korrelation zwischen den CTC-Subtypen ermittelt werden. Mittels der zweiten Anreicherungsmethode konnten beide CTC-Subpopulationen in 56 % der Blutproben detektiert und die fehlende Korrelation der Positivitätsrate bestätigt werden. In 7 % der EpCAM-niedrig/negativen Zellen konnte das Genom mit hoher Integrität amplifiziert werden, die DNA von EpCAM-hohen Zellen, welche jeweils aus denselben Proben isoliert wurden, konnte dagegen in 28 % mit hoher Integrität amplifiziert werden. Diese Ergebnisse suggerieren erhöhte Apoptoseraten innerhalb der ersten CTC-Gruppe, die weitere Nachforschungen erfordern. CTCs mit PIK3CA-Mutationen wurden in 4/10 der Patientenprobenidentifiziert. Eine Patientin wies dabei nur in EpCAM-niedrig/negativen CTCs die Mutation E545K auf und zwei Patientinnen wiesen die Mutationen H1047L und H1047R nur innerhalb der EpCAM-hohen CTCs auf. Die vierte Patientin wies Mutationen in beiden CTC-Gruppe auf: die Mutation E545K in einer EpCAM-niedrig/negativen CTC und die H1047L Mutation in zwei EpCAM-hohen CTCs. In der vorliegenden Arbeit konnten drei stabile Arbeitsläufe erfolgreich etabliert werden. Sie ermöglichen die gleichzeitige Anreicherung, Isolation und Analyse von EpCAM-hohen und EpCAM-niedrig/negativen CTCs aus dem Blut metastatischer Mammakarzinom Patientinnen. Zum ersten Mal wurde ein heterogener PIK3CA-Mutationsstatus innerhalb EpCAM-niedrig/negativer CTCs festgestellt. In zukünftigen Experimenten soll die Patientenkohorte erhöht werden. Außerdem werden die Follow-up-Daten der Patientinnen mit der Anzahl der EpCAM-niedrig/negativen CTCs und der Anwesenheit von PIK3CA Mutationen korreliert, um diese CTC-Gruppe besser zu verstehen und die Rolle des PIK3CA Onkogens als Biomarker für Therapie-Resistenz zu erforschen.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät
Dokument erstellt am:	11.05.2018
Dateien geändert am:	11.05.2018
Promotionsantrag am:	07.11.2017
Datum der Promotion:	26.04.2018