Dokument: Entwicklung einer Enzymplattform für die biokatalytische Synthese von Gallensäure-Derivaten

Titel:	Entwicklung einer Enzymplattform für die biokatalytische Synthese von Gallensäure-Derivaten
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=42742
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20190710-102618-8
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Bakonyi, Karl Daniel [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 9,99 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 27.06.2017 / geändert 27.06.2017
Beitragende:	Prof. Dr. Hummel, Werner [Betreuer/Doktorvater] Prof. Dr. Jaeger, Karl-Erich [Gutachter]
Stichwörter:	Biokatalyse; Protein-engineering
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibung:	Aufgrund der komplexen Regio- und Stereochemie ist die chemische Synthese von Ursodesoxycholsäure bisher mit einem Aufwand verbunden, der zu hohen Ausbeuteverlusten führt. Ursodesoxycholsäure wird unter anderem zur nicht-invasiven Behandlung von Gallensteinen eingesetzt und stellt ein wichtiges Pharmakon dar, das immer höheren Zuspruch findet. Zum Erreichen dieses Ziels stellt die Biotransformation durch den Einsatz von mikrobiellen Hydroxysteroid-Dehydrogenasen als Biokatalysator ein geeignetes Tool dar. Durch das Einbringen des enzymatischen Schrittes werden im Vergleich zur chemischen Synthese, bei der sieben Stufen benötigt werden, nur noch zwei chemische Schritte (Oxidation von Cholsäure zu Dehydrocholsäure sowie die Entfernung der Carbonylgruppe von 12-Keto-UDCA) benötigt, die den Herstellungsprozess bei höheren Ausbeuten verkürzt. Neben der Biotransformation mittels isolierter Enzyme wurde auch ein biokatalytischer Ganzzellprozess ausgearbeitet. Diese „designer bugs“ enthalten sowohl die beiden HSDHs als auch das Cofaktor-regenerierende Enzym. Für die weitere Optimierung des Prozesses wurde mittels rationalem Protein Designs die Cofaktorspezifität der 7β-HSDH geändert. Das Enzym ist als Wildtyp strikt NADP(H)-abhängig und konnte durch Sequenz- und Strukturinformationen erfolgreich geändert werden, so dass nur noch die unphosphorylierte Form des Coenzymes akzeptiert wird. Weiterhin konnte bei der Charakterisierung der HSDHs eine Substratüberschussinhibierung festgestellt werden. Die Inhibierung fällt bei der 3α-HSDH bedeutend ausgeprägter als bei der 7β-HSDH aus. Betrachtet man die Kinetik der HSDHs, so würde eine Eliminierung bzw. Verminderung der Inhibierung die Reaktionsführung bedeutend erleichtern. Aufgrund dieser Charakteristik wurde in dieser Arbeit ein großes Augenmerk auf die Mutagenese der vorhandenen HSDHs gesetzt. Hier konnte bei der 7β-HSDH eine Mutante erzeugt werden, dass das Enzym zum einen keine Substratinhibierung mehr besitzt und zum anderen eine um den Faktor 6 bis 7 erhöhte spezifische Aktivität besitzt. Analog zur Mutagenese der 7β-HSDH wurde die 3α-HSDH optimiert und eine Mutante erzeugt, die zwar noch eine Substratinhibierung aufweist, aber eine bedeutend höhere Aktivität besitzt. Weiterhin konnte ein Einfluss des 6xHistidin-Tag am C-Terminus nachgewiesen werden, der die ausgeprägte Substratinhibierung in niedrigen Konzentrationsbereichen und auch die Thermostabilität des Proteins vermindert. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war es, alternative Syntheserouten zur Gewinnung von Ursodesoxycholsäure zu finden. Chenodesoxycholsäure bietet den Vorteil, dass durch die Epimerisierung der α-ständigen zur β-ständigen Hydroxylgruppe am C7-Atom keine weiteren Schritte (chemische als auch enzymatische) benötigt werden. Hierfür wurde eine mikrobielle 7α-HSDH aus E. coli, die eine hochspezifische Aktivität aufweist sowie eine neuartige aus Clostridium difficile, die keine Substratinhibierung mit dem Cofaktor NADPH aufweist, identifiziert und kloniert. Der enzymatische Syntheseweg mit externer Cofaktorregenerierung ist dadurch möglich, weil der oxidative von dem reduktiven Schritt mittels Cofaktorspezifität der beiden eingesetzten Hydroxysteroid-Dehydrogenasen klar getrennt werden konnte. Sowohl mit isolierten Enzymen als auch mit einem Ganzzellbiokatalysator konnten vollständige Umsätze erreicht werden. Ein Weg der bislang noch nicht beschrieben wurde, ist ein chemoenzymatischer Weg, der ebenfalls von Chenodesoxycholsäure ausgeht. Somit konnte durch biochemische Charakterisierung und Optimierung der Enzymeigenschaften in dieser Arbeit eine Enzymplattform etabliert werden, die es ermöglicht, auf vier unterschiedlichen (chemo)-enzymatischen Synthesewegen zum Arzneistoff UDCA bzw. zur Vorstufe 12-Keto-UDCA zu gelangen.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Enzymtechnologie
Dokument erstellt am:	10.07.2019
Dateien geändert am:	10.07.2019
Promotionsantrag am:	09.11.2016
Datum der Promotion:	01.03.2001