Dokument: Development and application of computational tools for high content image analysis (HCA) of neural cells

Titel:	Development and application of computational tools for high content image analysis (HCA) of neural cells
Weiterer Titel:	Entwicklung und Anwendung von informatischen Methoden für die "High Content" Bildanalyse (HCA) von neuralen Zellen
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=37049
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20160203-100859-8
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Schmuck, Martin Roland [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 11,30 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 02.02.2016 / geändert 02.02.2016
Beitragende:	Prof. Dr. Fritsche, Ellen [Betreuer/Doktorvater] Prof. Dr. Schmitt, Lutz [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Neurodevelopmental toxicants represent a serious threat for society, clearly demonstrating the need for developmental neurotoxicity (DNT) testing. However, testing according to the current guidelines based on animal experiments is extremely time- and cost-intensive. Therefore, alternative testing approaches based on in vitro studies in combination with novel tools and strategies as proposed in the Tox21 concept are highly desirable. A promising in vitro system for DNT testing are neural progenitor cells (NPCs) grown as 3D neurospheres, which mimic several basic processes of fetal brain development, like migration and differentiation, in vitro. In the present dissertation a new DNT testing workflow of chemicals within the 3D neurosphere system employing high content image analyses (HCA) was developed. Therefore, suitable sample preparation and automated microscope scanning protocols as well as self-developed software were designed. We developed the software Omnisphero to assess classical neuronal endpoints like neuronal quantification and morphology as well as the neurosphere-specific endpoints dealing with spatial distribution of cells within the entire well like migration distance, migration pattern and neuronal density distributions. For regional quantification of BrdU+ (Bromodeoxyuridine) cells in brain slices in vivo the software BrdeLuxe was developed. This thesis demonstrates the capability of Omnisphero to assess relevant endpoints of the 'Neurosphere Assay' for medium throughput DNT substance screening: the effects of three model substances with known effects on relevant developmental endpoints (methylmercury, acrylamide, epidermal growth factor (EGF)) and one so far unknown DNT compound (epigallocatechin gallate, EGCG) were assessed. For neurospheres treated with the model substances, Omnisphero reached a detection power (DP) of 80-85% and a false positive rate (FPR) of 10-15% for neuronal quantification outperforming foreign automated evaluations (Thermo Scientific; DP: 50%, FPR: 40%). The high DP and low FPR was shown to be crucial for assessing neuronal morphology, since the high FPR of the foreign software caused an introduction of artificial branching points. Omnisphero also assessed the neurosphere-specific endpoint ‘radial cell migration’ by identifying the neurosphere core as a single object and determining migration distance as an average of the distances between the rim of the neurosphere core and all nuclei positions, obtained for the Array Scan technology, with the furthest migration distances with comparable precision than manual evaluations. Another self-written algorithm for the first time quantified positioning of individual cell types within the identified migration area leading to a distance-dependent density distribution. For the so far unknown DNT compound EGCG Omnisphero generated a substance-specific fingerprint with neurosphere endpoints that were established for HCA. This specific fingerprint was well distinguishable from other investigated compounds and could be attributed to the mode of action of disrupted cell adhesion. Altered adhesion was caused by EGCG interfering with laminin-integrin binding. This caused a chaotic glia phenotype and subsequent disturbance of neuronal migration. These in vitro results were compared to in vivo data from EGCG treated rats by assessing positioning of BrdU (bromodeoxyuridine)-labeled cells in cortical brain slices by a second algorithm developed within this work, BrdeLuxe, allowing an in vitro in vivo comparison. In conclusion, HCA of neurospheres is a promising technique for DNT medium throughput screening which might be used in safety and efficacy testing in the future – with additional features also for in vivo evaluations. Entwicklungsneurotoxische Substanzen stellen eine ernste Bedrohung für die Gesellschaft dar und erfordern daher geeignete Methoden zur Erfassung von Entwicklungsneurotoxizität (ENT). Jedoch sind Tests nach den momentanen Richtlinien, welche auf Tierversuchen basieren, extrem kosten und zeitaufwändig. Daher sind alternative Testmethoden basierend auf in vitro Studien in Kombination mit neuen Technologien und Strategien, wie sie innerhalb des Tox21 Konzeptes vorgeschlagen werden, in hohem Masse wünschenswert. Ein vielversprechendes in vitro System für ENT Prüfung stellen neurale Progenitorzellen (NPCs), kultiviert als 3D Neurosphäre dar, da sie einige wesentliche Prozesse der Gehirnentwicklung wie Migration und Differenzierung in vitro nachahmen. In der vorliegenden Dissertation wurde ein Workflow zur Erfassung entwicklungsneurotoxischer Substanzeigenschaften im 3D Neurosphärenmodel mittels "High Content" Bildanalysen entwickelt. Dafür wurden geeignete Probenpräparations-, automatische Bildaufnahmeprotokolle und eine eigene Auswertungssoftware entwickelt. Die Auswertsoftware "Omnisphero" analysiert klassische Endpunkte wie neuronale Quantifizierung und Morphologie sowie Neurosphären-spezifische Endpunkte, die die räumliche Verteilung von Zellen im gesamten Well betreffen, wie Migrationsdistanz, Migrationsmuster und neuronale Dichteverteilungen. Für die räumliche Quantifizierung von BrdU (Bromdeoxyuridin)+- Zellen in Gehirnschnitten in vivo wurde die Software "BrdeLuxe" entwickelt. Diese Arbeit belegt die Leistungsfähigkeit von Omnisphero, relevante Endpunkte des "Neurosphären Assays" für Substanzprüfungen im mittleren Durchsatz zu analysieren. Hierzu wurden die Effekte von drei Modellsubstanzen mit bekannten Effekten auf entwicklungsrelevante Endpunkte (Methylquecksilber, Acrylamid, epidermaler Wachstumsfaktor) und die bislang unbekannte ENT Substanz Epigallocatechingallat (EGCG) untersucht. Für die mit Modellsubstanzen behandelten Neurosphären erreichte Omnisphero eine Detektionsfähigkeit (DP) von 80-85 % mit einer Falscherkennungsrate (FPR) von 10-15% für die neuronale Quantifizierung und übertraf damit andere automatische Auswertungssysteme (Thermo Scientific; DP: 50%, FPR: 40%). Die Relevanz einer hohen DP und niedrigen FPR für die Analyse der neuronalen Morphologie wird dadurch deutlich, dass die hohe FÜR der bisher genutzten Software zu einer Identifizierung von artifiziellen Verzweigungspunkten in Neuriten fuhrt. Omnisphero analysiert des Weiteren den Neurosphären-spezifischen Endpunkt "radiale Zellmigration" mit vergleichbarer Präzision wie manuelle Messungen, indem der Neurosphärenkern als einzelnes Objekt identifiziert und die Migrationsstrecke als Mittelwert der Distanz zwischen dem Rand des Neurosphärenkerns und den am weitesten migrierten Zellkernpositionen, welche durch die Array Scan Technologie bestimmt wurden, berechnet wird. Ein weiterer selbst entwickelter Algorithmus quantifiziert erstmalig die Position einzelner Zelltypen innerhalb der identifizieren Migrationsflache und erfasst damit Abstands-abhängige Dichteverteilungen. Für die bis dahin unbekannte ENT Substanz EGCG konnte mit Omnisphero ein Substanz-spezifischer Fingerabdruck mittels der für HCA etablierten Neurosphärenendpunkte generiert werden. Dieser spezifische Fingerabdruck war eindeutig von denen anderer Substanzen abgrenzbar und konnte auf eine gestörte Zelladhäsion zurückgeführt werden. Die beeinträchtigte Adhäsion wurde durch die Störung der Laminin-Integrin Bindung durch EGCG hervorgerufen. Diese führte zu einem chaotischen Glia-Phänotyp und einer anschließenden beeinträchtigten neuronalen Migration. Diese in vitro Ergebnisse wurden mit in vivo Daten von EGCG behandelten Ratten verglichen, indem die Positionierung von BrdU markierten Zellen in Großhirnrindenschichten mittels eines zweiten Algorithmus, BrdeLuxe, analysiert wurde und dadurch einen in vitro in vivo Vergleich ermöglichte. Zusammenfassend kann die Schlussfolgerung getroffen werden, dass die HCA von Neurosphären eine vielversprechende Technik für die ENT Prüfung im mittleren Durchsatz darstellt, welche in Sicherheits- und Wirksamkeitsstudien in der Zukunft Anwendung finden konnte - mit erweiterten Applikationen für in vivo Analysen.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät
Dokument erstellt am:	03.02.2016
Dateien geändert am:	03.02.2016
Promotionsantrag am:	12.11.2015
Datum der Promotion:	10.12.2015