Dokument: Biokatalytische Synthese von α-Ketoglutarat und „Protein Engineering“ der NADH-Oxidase aus Lactobacillus brevis zur in situ-Cofaktorregenerierung von NADP+

Titel:	Biokatalytische Synthese von α-Ketoglutarat und „Protein Engineering“ der NADH-Oxidase aus Lactobacillus brevis zur in situ-Cofaktorregenerierung von NADP+
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=37048
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20160203-125943-3
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Dipl.-Ing. (FH) Lanzerath, Carsten [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 13,32 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 02.02.2016 / geändert 02.02.2016
Beitragende:	Prof. Dr. Hummel, Werner [Gutachter] Prof. Dr. Urlacher, Vlada B. [Gutachter]
Stichwörter:	Biotransformation, α-Ketoglutarat, Cofaktorregenerierung, NAD(P)H-Oxidase, „Protein Engineering“
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibung:	α-Ketoglutarat (α-KG) ist von großer industrieller Bedeutung für die chemische und pharmazeutische Industrie. Bisher wurde α-KG auf chemischem Wege oder mit Hilfe von fermentativen Verfahren hergestellt. Eine interessante, bisher jedoch kaum beachtete, Syntheseroute stellt die enzymatische Biotransformation von L-Glutamat (L-Glu) dar. Aufgrund der hohen Bedeutung von α-KG und der kostengünstigen Verfügbarkeit der korrespondierenden Aminosäure L-Glu wurden im Verlauf dieser Arbeit enzymatische Verfahren zur Darstellung von α-KG aus L-Glu entwickelt. Zu diesem Zweck wurden die Enzyme L-Glutamat-Dehydrogenase (GluDH), L-Glutamat-Oxidase (GluOX) sowie L-Glutamat-Pyruvat-Transaminase (GPT) als Biokatalysatoren in der Biotransformation eingesetzt. Hierbei unterscheiden sich die Enzyme deutlich hinsichtlich der Art der katalysierten Reaktion, den benötigten Cofaktoren bzw. Co-Substraten sowie den entstehenden sekundären Produkten, so dass jedes Enzym individuelle Anforderungen an die Bedingungen der Biotransformation stellt. Von den untersuchten Enzyme erzielte die GluOX mit Abstand die besten Ergebnisse in der Biotransformation von L-Glu zu α-KG, es wurden vollständige Umsätze und hohe Produktausbeuten erreicht. Hierbei wurden sowohl isolierte Enzyme, immobilisierte Enzyme als auch ein Ganzzellkatalysator erfolgreich in der Biotransformation eingesetzt. Im Vergleich zu den bisher publizierten biotechnologischen Verfahren liefert das GluOX-Verfahren eine vergleichbare oder sogar deutlich höhere Produktendkonzentration verbunden mit einer signifikant verbesserten Raum-Zeit-Ausbeute. Zusammenfassend scheint die enzymatische Biotransformation von L-Glu unter Verwendung einer GluOX eine unter ökologischen und ökonomischen Gesichtspunkten höchst interessante und konkurrenzfähige Synthesealternative für α-KG darzustellen. Nach dem heutigen Stand der Technik existieren kaum funktionelle enzymatische Regenerierungssysteme für den oxidierten Nicotinamid-Cofaktor NADP+. Um ein geeignetes enzymatisches Regenerierungssystem für NADP+ zu entwickeln und um Zusammenhänge von Struktur und Funktion der NOX aus L. brevis aufzuklären, wurde im Verlauf dieser Arbeit, mittels Methoden des „Protein Engineerings“ die Substratspezifität der NOX verändert, um die Oxidation von NADPH zu ermöglichen. Durch die Strukturanalyse der Wildtyp-NOX sowie den Struktur- und Sequenzvergleich mit anderen NAD(H)-, NADP(H)- und NAD(P)(H)-abhängigen Pyridin-Nucleotid-Disulfid Oxidoreduktasen (PNDOR) gelang es, Kenntnisse über den NADH-Bindungsmechanismus und die Strukturfunktionsbeziehungen des Enzyms zu erlangen, so dass die Aminosäuren identifiziert werden konnten, welche für die strikte NADH-Spezifität und die Diskriminierung der NADPH-Bindung von Bedeutung sind. Mittels ortsgerichteter Mutagenese gelang es Mehrfachmutanten zu generieren, die sowohl eine hohe katalytische Aktivität als auch Affinität gegenüber NADPH aufweisen. Verschiedene NOX-Mutanten wurden hinsichtlich der präparativen Anwendung zur in situ-Regenerierung von NADP+ bzw. NAD+ anhand der Synthese von enantiomerenreinen Alkoholen charakterisiert. Hierzu wurden unter Verwendung isolierter Enzyme gekoppelte Biotransformationen von rac-1-Phenylethanol mit Hilfe von NADP+- und NAD+-abhängigen Alkohol-Dehydrogenasen (ADHs) durchgeführt. Es konnte mit allen ADHs eine quantitative bzw. nahezu quantitative stereoselektive Oxidation des jeweiligen (R)- bzw. (S)-Alkohols erreicht werden (ee zwischen 97 % und 100 %), hierbei konnten „total turnover numbers“ (TTN) für NADP+ von annähernd 500 bzw. 1.000 erzielt werden. Ebenfalls wurden Ganzzellbiokatalysatoren mit NADP+-abhängigen ADHs sowie einer NOX-Mutante zur Regenerierung des Cofaktors konstruiert. Nach aktuellem Kenntnisstand gelang damit zum ersten Mal die Konstruktion von Ganzzellbiokatalysatoren mit zellinterner Cofaktorregenerierung von NADP+. Die Ergebnisse der Biotransformationen zeigen, dass sich die NOX-Mutanten für die in situ-Regenerierung des Cofaktors NADP+ eignen und in der Lage sind, einen biotechnologischen Prozess in Hinsicht auf die Cofaktorregenerierung ökonomisch und ökologisch zu gestalten.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Enzymtechnologie
Dokument erstellt am:	03.02.2016
Dateien geändert am:	03.02.2016
Promotionsantrag am:	26.06.2015
Datum der Promotion:	17.12.2015