Dokument: Ensemble-basierter Ansatz für die Untersuchung von Dynamisch Dominierter Allostery

Titel:	Ensemble-basierter Ansatz für die Untersuchung von Dynamisch Dominierter Allostery
Weiterer Titel:	Ensemble-Based Framework for Analyzing Dynamically Dominated Allostery
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=33206
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20150122-112535-6
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Pfleger, Christopher [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 26,37 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 21.01.2015 / geändert 21.01.2015
Beitragende:	Prof. Dr. Gohlke, Holger [Gutachter] Prof. Dr. Martin Lercher [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Die Vorhersage von allosterischer Regulation in Biomolekülen ist von besonderem Interesse in der modernen Wirkstoffentwicklung, z. B. besitzen allosterische Effektoren einen Selektivitätsvorteil gegenüber „konventionellen“ kompetitiven Liganden. Allerdings stellen die verschiedenen Mechanismen der allosterischen Regulation eine große Herausforderung für die Identifikation neuer allosterischer Bindestellen dar. Die klassische Sichtweise der allosterischen Regulation beinhaltet das Auftreten einer Konformationsänderung wohingegen in der neuen Sichtweise die Änderung der Proteindynamik hinzugefügt wurde. Insbesondere, der letztgenannte Fall ist aufgrund fehlender Konformationsänderungen herausfordernd und anhand statischer Kristallstrukturen schwer zu identifizieren. Bis zum heutigen Zeitpunkt existiert kein Methode für die routinemäßige Untersuchung solcher Dynamik-gesteuerter Allostery hinsichtlich Vorhersage von Freien Energien für die Kooperativität und Beschreibung der Signalweiterleitung zwischen entfernten Stellen. In dieser Arbeit habe ich einen Ensemble-basierten Störungsansatz entwickelt, um Freien Energien für die Kooperativität und allosterische Signalweiterleitung in Biomolekülen vorherzusagen. Der Kern dieses Ansatzes ist eine Graphen-basierter Methode für die effiziente Identifikation von flexiblen und rigiden Regionen in Biomolekülen. Für eine sinnvolle Verknüpfung von solchen Stabilitätsanalysen mit biologisch relevanten Informationen, habe ich zunächst Richtlinien für die Anwendung und Interpretation von bekannten und neuen Index-Definitionen ausgearbeitet (Publikation I). Ein Nachteil von Graphen-basierten Stabilitätsanalysen ist ihre hohe Empfindlichkeit hinsichtlich der verwendeten Eingabestruktur. Um die Empfindlichkeit zu reduzieren, wurden bisher Strukturensembles aus rechenintensiven MD Simulationen verwendet. Als eine Alternative habe ich eine effiziente Methode entwickelt, die die thermische Fluktuationen in Biomolekülen simuliert (Publikation II). Dies führte zu einer Weiterentwicklung des Constraint Network Analysis (CNA) Verfahrens hinsichtlich einer effizienteren Ensemble-basierten Stabilitätsanalyse. Zusätzlich beinhaltet die Weiterentwicklung eine automatisierte Berechnung von globalen und lokalen Indices sowie eine robuste Prozedur für die korrekte Netzwerkdarstellung von Ligand-Molekülen. Diese Arbeiten führten schließlich zu der Entwicklung des benutzerfreundlichen Programmes CNA (Publikation III). Das Programm CNA wurde für die Untersuchung von Stabilitätsänderungen durch Einfügen von in silico Störungen in Interaktionsnetzwerken verwendet (Publikation IV). Die Validierungsstudie an Eglin c zeigte eine sehr gute Korrelation bezüglich vorhergesagten und experimentellen freien Energien mutationsbedingter Stabilitätsänderungen sowie eine hohe Übereinstimmung der Pfadvorhersage mit Dynamikänderungen von Resten in einer NMR Studie. Anschließend wurde der Störungsansatz auf Protein Tyrosin Phosphatase 1B (PTP1B) und Leukozyten Funktionsassoziierte Antigen-1 (LFA-1) angewendet. Für beide Systeme wurden anhand von in silico Störungen in der allosterischen Bindestelle langreichweitige Stabilitätsänderungen gefunden, die allosterische und orthosterische Stelle verbinden. Die Berechnung der Freien Energie für die Kooperativität in LFA-1 zeigte, dass eine nicht-additive Stabilisierung durch das Binden des allosterischen Effektors und des natürlichen Substrats vorliegt. Diese nicht-additive Stabilisierung entspricht der zugrundeliegenden negativen Kooperativität, die experimentell für LFA-1 gefunden wurde. Für zukünftige Projekte bietet dieser Störungsansatz eine ausgezeichnete Möglichkeit für die effiziente Untersuchung von Systemen mit unbekanntem allosterischen Mechanismus. Zunächst werden Biomoleküle mittels PocketAnalyzer (Publikation V) nach neuen Bindestellen untersucht. Die Eignung von PocketAnalyzer wurde in einer Studie für die Identifikation von transienten Bindetaschen in der Protein-Protein Interaktionsfläche von Interleukin-2 gezeigt (Publikation VI). Anschließend werden identifizierte Bindetaschen hinsichtlich ihrer allosterischen Funktion überprüft, z. B. durch gezieltes Einfügen von Störungen im Interaktionsnetzwerk der Bindetaschen. Die Änderung der thermischen Fluktuation kann anschließend mittels einer modifizierten Variante des Ansatzes aus Publikation II untersucht werden. Die Informationen über die chemischen Eigenschaften potentieller allostersicher Bindestaschen kann abschließend in einem Virtual Screening Ansatz verwendet werden, um Leitstrukturen für neuartige allosterische Effektoren zu identifizieren. Understanding the mechanism of allosteric regulation in biomacromolecules is of great interest both from a fundamental point of view and in drug discovery. Over the last decades, aspects of dynamics extended the classical view of conformational allostery. This type of dynamically dominated allostery can occur in the absence of conformational changes, and thus, is difficult to deduce from static X-ray structures and computational methods in a routine way. In this thesis, I developed a novel ensemble-based perturbation approach for analyzing dynamically dominated allostery. To this end, mechanical perturbation free energies and cooperative free energies were deduced from rigidity analysis using a constraint network representation of biomacromolecules. For deriving maximal advantage from such a rigidity analysis, I provided guidelines for the usage of rigidity indices and how to link them with biologically relevant information. In order to overcome the sensitivity problem of rigidity analysis, I developed an efficient method for simulating thermal fluctuations at the level of a constraint network of a biomacromolecule. Hence, I improved the Constraint Network Analysis (CNA) approach, leading to the CNA software package which. For the first time, CNA provides an efficient ensemble-based rigidity analysis, automated calculation of indices, and robust treatment of ligand molecules. Next, CNA was used to analyze changes in stability upon in silico perturbations on ensembles of network topologies. The approach was validated by mutational perturbations on eglin c, which showed a good correlation between predicted and experimental free energies for stability changes and almost perfectly reproduced a continuous pathway of dynamically coupled residues as found in NMR studies. Applied on PTP1B and LFA-1, the framework demonstrated its performance to detect long-range altered rigidity connecting allosteric and orthosteric sites. Finally, the predicted positive free energy for allosteric cooperativity in LFA-1 is in agreement with the underlying mechanism of negative cooperativity found experimentally for LFA 1. This framework for analyzing dynamically dominated allostery provides an excellent tool for studying systems with yet unknown allosteric mechanisms. To this end, I outlined a computational methodology for the detection of novel allosteric sites and for probing the allosteric response. Preliminary results are encouraging, which demonstrates that this methodology can be an efficient tool for targeting allosteric regulation in drug discovery in a routine way.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät
Dokument erstellt am:	22.01.2015
Dateien geändert am:	22.01.2015
Promotionsantrag am:	01.12.2014
Datum der Promotion:	18.12.2014