Dokument: Molekulargenetische, biochemische, strukturelle und mechanistische Charakterisierung mikrobieller Oxidasen

Titel:	Molekulargenetische, biochemische, strukturelle und mechanistische Charakterisierung mikrobieller Oxidasen
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=3268
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20101130-101235-7
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Kuzu, Mutlu [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 2,47 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 09.02.2007 / geändert 09.02.2007
Beitragende:	Prof. Dr. Hummel, Werner [Gutachter] Prof. Dr. Willbold, Dieter [Gutachter]
Stichwörter:	Enzyme, Oxidasen, NADH Oxidasen, Aminosäureoxidasen, Aminosäuren, Alkohole, chirale Bausteine, Biotransformation, Strukturaufklärung, 3D Struktur
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibung:	In dieser Arbeit wurden für vier technisch interessante Oxidasen NADH-Oxidase aus Lactobacillus brevis (NOX), L -Aminosäureoxidase aus Rhodococcus opacus (RoLAAO) und D-Aminosäureoxidase aus Arthrobacter protophormiae (ApDAAO) sowie die D-Aminosäureoxidase aus Trigonopsis variabilis (TvDAAO) Expressionssysteme entwickelt und strukturelle sowie mechanistische Untersuchungen durchgeführt. Mit diesen Enzymen sollen neue Syntheserouten für die Herstellung eines breiten Spektrums an D- und L-Aminosäuren, Ketosäuren, Alkoholen und Ketoverbindungen eröffnet werden. Die NOX aus L. brevis katalysiert die Oxidation von NADH zu NAD+, wobei Nebenprodukt dieses Enzyms Wasser (H2O) ist, das durch Reduktion von molekularem Sauerstoff (O2) entsteht. Im Gegensatz dazu bilden die H2O2-bildenden NADH-Oxidasen als reduziertes Nebenprodukt Wasserstoffperoxid (H2O2), welches für die Zellen toxisch ist. Aufgrund dieser Besonderheit der NOX wurde das nox-Gen in verschiedene E. coli-Expressionsvektoren kloniert und in verschiedene E. coli-Stämme transformiert. Es wurden außerordentlich hohe spezifische Aktivitäten für die NOX erzielt. Anschließend wurde die NOX umfassend protein- und biochemisch charakterisiert. Da bisher keine Struktur einer H2O-bildenden NOX beschrieben wurde, sollte die gut verfügbare NOX aus L. brevis kristallisiert und die 3D-Struktur gelöst werden. In Zusammenarbeit mit dem Institut für Biochemie der Universität Köln wurde die NOX in kürzester Zeit kristallisiert. Ein kompletter Datensatz wurde mit einem Kristall des NOX-Holoenzyms mit Synchrotronstrahlung bis zu einer Auflösung von 2,7 Å gemessen. Aufgrund der hohen Sequenzidentität der NOX zur NADH-Peroxidase aus Enteroccocus faecalis mit 42,3 % konnte die 3D-Struktur der NOX erfolgreich mittels molekularem Ersatz gelöst werden. Nach dem Vorliegen der 3D-Struktur wurde auch bald der Reaktionsmechanismus aufgeklärt und mit anderen Oxidasen verglichen. Da die NOX sehr gut verfügbar ist und einen relativ kleinen KM-Wert für NADH besitzt, wurde die NOX als Regenerationssystem für NAD+ bei der Kopplung mit NAD+-abhängigen L-, (R)- oder (S)-spezifischen Dehydrogenase während der Racematspaltung eingesetzt. Durch die Kopplung der NOX mit verschiedenen Dehydrogenasen (Aminosäure- u. Alkohol-Dehydrogenasen) wurden verschiedene (R)- und (S)-Alkoholen und diverse D-Aminosäuren mit hoher Enantiomerenreinheit (95 bis praktisch 100 %) erreicht. L-AAOs katalysieren die oxidative Desaminierung von L-Aminosäuren zu Ketosäuren unter Freisetzung von Ammoniak und Wasserstoffperoxid. L- und D-spezifische AAOs sind aufgrund ihrer Gleichgewichtslage, die die Bildung der oxidierten Produkte unterstützt, sowohl für die Racemattrennung als auch für die direkte Desaminierung von L- und D-Aminosäuren zu Ketosäuren sehr gut geeignet. Als weiterer Vorteil ist zu erwähnen, dass in diesen Prozessen nur maximal zwei Enzyme erforderlich sind, die L-AAO und bei oxidationsempfindlichen Verbindungen zusätzlich Katalase. Die wesentliche Limitierung bei der Anwendung dieser Enzyme ist bislang die Verfügbarkeit. In dieser Arbeit wurde daher als weiterer Schwerpunkt die Expression einer L-AAO (aus Rhodococcus opacus) und zweier D-AAOs (aus Trigonopsis variabilis und aus Arthrobacter protophormiae) bearbeitet. Erstmals konnte eine aktive L-AAO aus R. opacus erfolgreich in E. coli exprimiert werden. Durch umfassende Klonierungsarbeiten wurde ein leistungsstarker rekombinanter E. coli-Expressionsstamm zur Bildung von L-AAO entwickelt. Durch anschließende Fermentation dieses E. coli-Stammes wurden sehr hohe Enzymmengen gewonnen. Aufgrund der guten Verfügbarkeit der RoLAAO wurden präparative Ansätze mit verschiedenen Enzympräparationen untersucht. Sämtliche Enzympräparationen erzielten im batch-Ansatz mit verschiedenen DL-Aminosäuren Enantiomerenüberschüsse von über 99% für die D-Aminosäure. Zum anderen wurden zwei D-Aminosäureoxidasen (TvDAAO und ApDAAO) in E. coli erfolgreich heterolog exprimiert. Auch für diese Enzyme konnten sehr gute Überexpressionssysteme entwickelt werden. Beide D-AAOs wurden umfassend biochemisch charakterisiert. Für die ApDAAO wurde außer-dem ein Strukturmodell erstellt und der Reaktionsmechanismus untersucht. Durch die erfolgreiche heterologe Expression von D- und L-spezifischen Aminosäureoxidasen wurden damit neue enzym-katalysierte Wege zur Synthese von D- und L-Aminosäuren und Ketosäuren eröffnet. In der Anwendung konnte mit verschiedenen Substraten gezeigt werden, dass sowohl Verfahren mit isolierten Enzymen als auch mit rekombinanten Ganzzell-Systemen hohe Enantiomerenüberschüsse (> 99 %) für die verbleibenden Aminosäuren ergeben.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie
Dokument erstellt am:	18.12.2005
Dateien geändert am:	12.02.2007
Promotionsantrag am:	16.12.2005
Datum der Promotion:	16.12.2005