Dokument: Development of computational approaches for knowledge-driven protein engineering aimed at improving thermostability

Titel:	Development of computational approaches for knowledge-driven protein engineering aimed at improving thermostability
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=31307
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20150820-111825-4
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Rathi, Prakash Chandra [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 14,51 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 02.11.2014 / geändert 02.11.2014
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 540 Chemie
Beschreibungen:	High thermostability is a desired property for proteins, in particular for their use in industrial bio-catalysis. A bio-catalyst with elevated thermostability allows carrying out catalysis at higher temperatures and, thus, to increase the rate of a reaction. However, most proteins in nature are not optimized to withstand harsh industrial process conditions including high temperatures. Therefore, engineering existing proteins by mutagenesis is often employed in order to produce thermostable variants. However, only a minor fraction of the large number of theoretically possible mutated variants of a protein can be tested experimentally for their thermostability. Computational approaches that predict weak spots, residues that are more likely to increase a protein’s thermostability upon mutation, are hence promising for protein engineering projects aimed at improving thermostability. In this thesis, I developed such computational approaches, a task that was subdivided in three main parts: I) To identify the most significant non-covalent interactions that determine a protein’s thermostability. II) To develop and improve approaches for predicting thermostabilizing mutations on a protein based on the outcome of part I. III) To validate these approaches by their retrospective and prospective application on test systems. In this compilation thesis, I showed that hydrophobic interaction energy is the most discriminating factor between mesophilic and (hyper)thermophilic protein homologs. Using this information, I developed an approach for predicting weak spots based on residue-wise hydrophobic interaction energies (Publication I). For the first time, I showed that the size of residue clusters that are identified based on residue-wise hydrophobic interaction energies discriminates mesophilic and (hyper)thermophilic proteins much better than the existence or size of clusters of hydrophobic residues alone. Based on this finding, I improved the rigidity theory-based Constraint Network Analysis (CNA) approach for predicting protein thermostability and weak spots by modeling hydrophobic interactions in a temperature-dependent manner, in addition to performing an ensemble-based CNA (Publication II). For an easy setup and extensive analysis of CNA calculations, we developed a software package, a web service, as well as a graphical user interface that facilitate protein engineering for improving thermostability (Publications III V). Next, I used CNA to study the relation of a protein’s structural rigidity and its thermodynamic thermostability using BsLipA as a test case for which thermodynamically thermostabilized variants are reported in the literature (Publication VI). For the first time, my systematic comparative study of BsLipA variants revealed that thermodynamic thermostabilization is unequivocally accompanied by increased structural rigidity, leading to a significant and good correlation between structural rigidity and thermodynamic thermostability of these variants. Finally, in order to validate the CNA approach, I developed a computational strategy for predicting thermostabilizing mutations and applied it to lipase A from Bacillus subtilis (BsLipA) prospectively. Experimental testing confirmed the predicted thermostabilization for three out of twelve mutated BsLipA variants (Publication VII). This study demonstrated, for the first time, that CNA can be applied prospectively for enriching thermostabilizing mutations on a protein. I am confident that the speed and prediction accuracy of these new and improved computational approaches will allow to investigate the basis of protein thermostability, to predict mutations that increase thermostability, and thus to improve the efficacy and efficiency of protein engineering projects. Hohe Thermostabilität ist eine erwünschte Eigenschaft von Proteinen, insbesondere für deren Einsatz in der industriellen Biokatalyse. Ein Biokatalysator mit erhöhter Thermostabilität ermöglicht die Durchführung einer Katalyse bei höheren Temperaturen und dadurch die Erhöhung der Reaktionsgeschwindigkeit. Allerdings sind die meisten Proteine in der Natur nicht dafür optimiert, harten industriellen Prozessbedingungen, einschließlich hoher Temperaturen, zu widerstehen. Daher wendet man häufig Protein-Engineering an, um thermostabile Varianten existierender Proteine zu erzeugen. Jedoch kann nur ein kleiner Teil der vielen theoretisch möglichen Varianten eines Proteins experimentell hinsichtlich Thermostabilität getestet werden. Daher sind computergestützte Ansätze zur Vorhersage von Weak Spots, Aminosäureresten deren Mutation die Thermostabilität eines Proteins voraussichtlich erhöht, vielversprechend für Protein-Engineering-Projekte zur Verbesserung der Thermostabilität. In dieser Arbeit entwickelte ich solche computergestützten Ansätze, eine Aufgabe die drei Teile umfasste: I) Die Identifikation der wichtigsten nicht-kovalenten Wechselwirkungen, welche die Thermostabilität eines Proteins bestimmen. II) Die Entwicklung und Verbesserung von Ansätzen zur Vorhersage thermostabilisierender Protein-Mutationen auf Grundlage der Erkenntnisse aus Teilaufgabe I. III) Die Validierung dieser Ansätze durch ihre retrospektive und prospektive Anwendung auf Testsysteme. In dieser kumulativen Arbeit zeigte ich, dass die hydrophobe Wechselwirkungsenergie der wichtigste Faktor bei der Unterscheidung von mesophilen und (hyper)thermophilen Protein-Homologen ist. Auf Basis dieser Information entwickelte ich einen Ansatz zur Vorhersage von Weak Spots auf Grundlage der hydrophoben Wechselwirkungsenergien einzelner Aminosäurereste (Publikation I). Erstmals zeigte ich, dass die Größe von Aminosäurerest-Clustern, die anhand hydrophober Wechselwirkungsenergien einzelner Aminosäurereste identifiziert wurden, ein wesentlich besseres Unterscheidungsmerkmal für mesophile und (hyper)thermophile Proteine ist als allein das Vorhandensein oder die Größe hydrophober Aminosäurerest-Cluster. Auf Grundlage dieser Erkenntnis verbesserte ich den auf der Rigiditäts-Theorie basierenden Constraint Network Analysis (CNA) Ansatz, um durch die temperaturabhängige Modellierung hydrophober Interaktionen und zusätzlich Ensemble-basierte CNA die Thermostabilität und Weak Spots von Proteinen vorherzusagen (Publikation II). Zur einfachen Vorbereitung und ausführlichen Analyse von CNA-Berechnungen, wurde ein Software-Paket, ein Web-Service als auch eine graphische Benutzeroberfläche entwickelt, welche das Protein-Engineering zur Verbesserung der Thermostabilität unterstützen. (Publikationen III–V). Ich verwendete sodann CNA zur retrospektiven Untersuchung der Beziehung zwischen der strukturellen Rigidität von Proteinen und deren thermodynamischer Thermostabilität, wobei Lipase A von Bacillus subtilis (BsLipA) als Testfall mit literaturbekannten thermodynamisch thermostabilisierten Varianten diente (Publikation VI). Meine vergleichenden Untersuchungen von BsLipA Varianten zeigten, dass eine thermodynamische Thermostabilisierung eindeutig mit einer erhöhten strukturellen Rigidität einhergeht. Diese Erkenntnis wurde in einer prospektiven Studie ausgenutzt: um den CNA-basierten Ansatz zu validieren, entwickelte ich eine computergestützte Strategie zur Vorhersage thermostabilisierender Mutationen und wendete diese auf BsLipA an. Experimentelle Tests bestätigten die vorhergesagte Thermostabilisierung für drei von zwölf mutierten BsLipA Varianten (Publikation VII). Diese Studie zeigte erstmals, dass CNA prospektiv zur Anreicherung thermostabilisierender Protein-Mutationen verwendet werden kann. Ich bin davon überzeugt, dass die Geschwindigkeit und Vorhersagegenauigkeit dieser neuen und verbesserten computergestützten Ansätze es ermöglichen werden, die Grundlagen der Thermostabilität von Proteinen zu erforschen, thermostabilisierende Mutationen vorherzusagen und dadurch die Wirksamkeit und Effizienz von Protein-Engineering-Projekten zu verbessern.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Pharmazie » Pharmazeutische und Medizinische Chemie
Dokument erstellt am:	20.08.2015
Dateien geändert am:	20.08.2015
Promotionsantrag am:	23.09.2014
Datum der Promotion:	31.10.2014