Dokument: Isolierung und Charakterisierung einer PQQ-abhängigen Alkoholdehydrogenase aus Pseudomonas sp. zur enantioselektiven Oxidation von racemischen Diolen

Titel:	Isolierung und Charakterisierung einer PQQ-abhängigen Alkoholdehydrogenase aus Pseudomonas sp. zur enantioselektiven Oxidation von racemischen Diolen
Weiterer Titel:	Isolation and Characterisation of a pqq depend alcohol dehydrogenase from Pseudomonas sp. for enantiomeric selective oxidation of racemic diols
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=29702
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20140606-095826-2
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Dr. Dehdari, Pedram [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 2,61 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 05.06.2014 / geändert 05.06.2014
Beitragende:	Prof. Dr. Hummel, Werner [Betreuer/Doktorvater] Prof. Dr. Jaeger, Karl-Erich [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 540 Chemie
Beschreibung:	Die regio- und stereoselektive Oxidation der primären Alkoholfunktion von 1,2-Diolen führt zu chiralen Hydroxyalkoholen oder chiralen Hydroxysäuren. Eine solche Oxidation kann im Prinzip mit den gut bekannten NAD+-abhängigen Alkohol-Dehydrogenasen oder mit FAD-abhängigen Alkohol-Oxidasen durchgeführt werden. Im Rahmen dieser Arbeit sollte für diese Anwendung das Potential von Chinoprotein-Alkohol-Dehydrogenasen untersucht werden, Cofaktor dieser Enzyme ist das Pyrollochinolin-Chinon (PQQ). In Vorversuchen konnte ein Bakterium (Pseudomonas sp.) identifiziert werden, das in der Lage ist, ausgehend von racemischem 1,2 Phenylethandiol das (R)-Enantiomer zu (R)-Mandelsäure zu oxidieren. Diese Oxidation kann vollständig ablaufen, so dass enantiomerenreines (S)-Phenylethandiol zurückbleibt. Versuche mit zellfreiem Extrakt haben gezeigt, dass die Oxidation als Cofaktor PQQ benötigt. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollte das für diese Umsetzung verantwortliche Enzym gereinigt, biochemisch charakterisiert und für chemoenzymatische Synthesen eingesetzt werden. Zur Produktion des Enzyms wurden Zellen von Pseudomonas sp. kultiviert, aufgeschlossen und der zellfreie Rohextrakt mit verschiedenen Diolen auf seine oxidative Wirkung hin getestet. Eine geeignete Reinigungsmethode wurde entwickelt und der Rohextrakt so weit wie möglich gereinigt. Die Charakterisierung hat gezeigt, dass der zugrundeliegende Katalysator ein Protein ist, dessen Größe der Proteinkette, Anzahl und Art der Aminosäuren aufgeklärt werden konnte. Die Sequenz konnte nicht festgestellt werden, da das Protein N-terminal blockiert und für den Edman-Abbau nicht zugänglich ist. Die enzymatischen Oxidationsreaktionen an einer Reihe von Diolen oder primären Alkoholen zeigten das präparative Potenzial des Enzyms auf. Eine Reihe von Diolen wurde enantioselektiv zu (R)-Hydroxysäuren oxidiert. Interessanterweise hat sich gezeigt, dass die eigentlich instabile Aldehydzwischenstufe, die häufig sofort zu einer Hydroxysäure weiteroxidiert wird, im Fall von Phenylethandiol isoliert werden konnte und als enantiomerenreiner Aldehyd für chemoenzymatische Reaktionen zur Verfügung stand. Bei der in situ-Kopplung mit einer Transketolase konnte über eine Aldolkondensation ein chiraler Zucker synthetisiert werden. In Zusammenarbeit mit Prof. Bäckvall (Universität Stockholm) wurde ein organometallischer Ru-Katalysator zur Racemisierung von sekundären Alkoholen erfolgreich eingesetzt. Hierbei ist der RuII-Katalysator, der die Reaktion der Racemisierung von reinem (S)-Diol zu rac. Diol katalysiert, genutzt worden, um die Ausbeute an (R)-Hydroxysäure zu erhöhen. Somit wird bei funktionierendem Racemisierungskatalysator eine Ausbeute an (R)-Hydroxysäure von > 50 % erwartet. In ersten, nicht-optimierten Umsetzungen konnte eine Steigerung auf 60% (R)- Mandelsäure erreicht werden. Eine besondere Methode, die hier eingesetzt wurde, ist der Verzicht auf einen Filter für eine Zweikammernutzung zur Trennung der beiden Reaktionsmedien, wie es bei homogenen oder nicht kompatiblen Phasen üblich ist. Die sauerstoffempfindliche organische Toluol¬phase, die unter Argonschutz steht, wurde ohne Einsatz eines Filters mit der wässrigen sauerstoffangereicherten Enzymphase direkt in einem Zweiphasensystem kombiniert. Die Reaktion wurde durch ein technisches Begasungssystem mit Sauerstoff und Argon gesteuert und erfolgreich eingesetzt.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Enzymtechnologie
Dokument erstellt am:	06.06.2014
Dateien geändert am:	06.06.2014
Promotionsantrag am:	12.03.2014
Datum der Promotion:	08.04.2014