Dokument: Proline-rich Akt substrate of 40 kDa (PRAS40): A new modulator and target of insulin action. Characterization of the function of PRAS40 in Akt- and mammalian target of rapamycin complex 1 (mTORC1)-signaling pathway.

Titel:	Proline-rich Akt substrate of 40 kDa (PRAS40): A new modulator and target of insulin action. Characterization of the function of PRAS40 in Akt- and mammalian target of rapamycin complex 1 (mTORC1)-signaling pathway.
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=28104
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20140116-155302-9
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Wiza, Claudia [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 25,56 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 16.01.2014 / geändert 16.01.2014
Beitragende:	Prof. Dr. Hadi Al-Hasani [Gutachter] Prof. Dr. Feldbrügge, Michael [Gutachter]
Stichwörter:	Typ2 diabetes, insulin resistance, IRS1, mTOR, PRAS40
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Nach neusten Schätzungen wird die weltweite Prävalenz von Diabetes von 366 Millionen Betroffenen im Jahr 2011 auf 552 Millionen im Jahr 2030 ansteigen. Diese Zahlen spiegeln die Notwendigkeit wider, dass die molekularen Mechanismen, die zu der Entstehung dieser Erkrankung führen, schnellstmöglich aufgedeckt werden, um neue therapeutische Strategien entwickeln zu können. Sowohl die Entstehung von Insulinresistenz im Skelettmuskel, Leber und Fettgewebe, als auch die Dysfunktion der β-Zellen des Pankreas bestimmen die Pathogenese des Typ 2 Diabetes (T2D). Dabei spielt vor allem die Entstehung einer Insulinresistenz im Skelettmuskel eine entscheidende Rolle. Die Sensitivität dieser Zellen auf Insulin zu reagieren ist dabei gestört, lange bevor klinische Symptome erkennbar sind. Jedoch sind die Ursachen und Faktoren, die zur Entstehung von Insulinresistenz beitragen, nicht zufriedenstellend aufgedeckt und verstanden. Zusätzlich sind noch immer nicht alle Bestandteile des Insulinsignalweges identifiziert, so dass die physiologische sowie auch pathophysiologische Regulation dieses zentralen Signalweges unzureichend verstanden wird. Aus diesem Grund ist ein zentrales Ziel der Diabetesforschung den Insulinsignalweg weiter zu charakterisieren und die Mechanismen aufzudecken, die eine Störung des Insulinsignalwegs im Skelettmuskel bewirken. Sowohl der Akt- als auch der mammalian target of rapamycin complex 1 (mTORC1)-Signalweg spielt eine entscheidende Rolle bei der Kontrolle und Regulierung der Insulinwirkung. Eine Dysregulation dieser Signalwege konnte bereits mit der Entstehung von Insulinresistenz in Verbindung gebracht werden. Das Protein proline-rich Akt substrate of 40 kDA (PRAS40) ist nicht nur Bestandteil und Substrat des Proteinkomplexes mTORC1 sondern auch eines derjenigen Proteine, die am stärksten durch die Proteinkinase Akt reguliert werden. Obwohl bereits gezeigt werden konnte, dass die Insulin-vermittelte Phosphorylierung von PRAS40 sowohl in Nagern nach einer Hochfett-Diät als auch in Menschen mit T2D reduziert ist, ist die Funktion dieses Proteins im Insulinsignalweg unvollständig aufgedeckt. Aufgrund dieser unzureichenden Kenntnisse über PRAS40 war das Ziel dieser Arbeit die Funktion von PRAS40 auf den Insulinsignalweg sowie auf den mTORC1-Signalweg in Skelettmuskelzellen zu untersuchen. Der Knockdown von PRAS40 führte zu einer verminderten Insulin-vermittelten Phosphorylierung von Akt und seinen Substraten. Zusätzlich war die Insulin-induzierte Aufnahme von Glukose in die Muskelzellen beeinträchtigt. Bei Abwesenheit von PRAS40 war Insulin zudem nicht mehr in der Lage, die mTORC1 Aktivität zu steigern, was auf eine verminderte Aktivität des PI3K/Akt/TSC2 Signalweges zurückzuführen ist. Die Beeinträchtigung der Insulinwirkung durch den Verlust von PRAS40 konnte durch eine verminderte Proteinexpression von insulin receptor substrate (IRS) 1 erklärt werden. Die Inhibierung der Kinase p70S6K, welche bekannt ist, den aktiven Abbau von IRS1 zu begünstigen, konnte weder die verminderte IRS1-Proteinexpression noch die Insulinsensitivität bei Abwesenheit von PRAS40 normalisieren. Im Gegensatz dazu, konnte die Reduktion der IRS1 Proteinabundanz durch den Knockdown von PRAS40 mit einer gesteigerten Aktivität des 26S Proteasoms und durch eine erhöhte Genexpression der E3-Ligasen MuRF1 und FBXO32 erklärt werden. Die pharmakologische Inaktivierung des Proteasoms in PRAS40-knockdown Zellen durch MG-132 normalisierte die IRS1 Proteinexpression sowie die Insulinsensitivität. Im Gegensatz zu diesen Ergebnissen bewirkte die Überexpression von PRAS40 eine signifikante Erhöhung der Insulinsensitivität in humanen Skelettmuskelzellen in vitro sowie in vivo in Mausmuskeln. Diese Effekte konnten erneut durch Veränderungen des IRS1 Proteinlevels erklärt werden. Die Überexpression von PRAS40 bewirkte eine verstärkte Proteinexpression von IRS1, was vornehmlich durch eine verminderte Aktivität des Proteasoms induziert wurde. Es stellte sich heraus, dass die positiven Effekte von PRAS40 auf die Aktivität des Proteasoms unabhängig von posttranslationalen Modifikationen (genauer gesagt Phosphorylierung) sowie von der Bindung von PRAS40 an mTORC1 vermittelt wurden. Im Gegensatz dazu, konnte die Insulinresistenz, die durch eine chronische Behandlung der Skelettmuskelzellen mit Insulin induziert wurde, nur durch Überexpression von PRAS40 aufgehoben werden, wenn Phosphorylierung von PRAS40 und/oder die PRAS40-mTORC1-Bindung ermöglicht werden konnte. Diese mTORC1-Bindung und Phosphorylierungsstellen waren zudem essentiell für die Inhibierung des mTORC1 durch PRAS40-Überexpression. Wir konnten des Weiteren zeigen, dass PRAS40 eine Sequenz besitzt, welche den Export von Proteinen aus dem Kern reguliert. Die Einfügung einer Mutation innerhalb dieser Sequenz führte zu einer verstärkten Akkumulierung von PRAS40 im Zellkern von A14 Fibroblasten und resultierte in einer verminderten Insulin-induzierten Aktivierung des Akt- und mTORC1 Signalweges. Schlussendlich konnten wir bestätigen, dass die Phosphorylierung von PRAS40 an Thr246 ein möglicher Biomarker für Insulinresistenz darstellt. Sfrp5, welches identifiziert wurde die Insulinwirkung in humanen Adipozyten zu modulieren, inhibierte die Insulin-vermittelte Phosphorylierung von Akt. Dieses spiegelte sich zusätzlich in einer verminderten Phosphorylierung von PRAS40 an Thr246 durch Insulin wider. Zusammenfassend zeigen unsere Daten, dass PRAS40 als ein neuer Modulator der Insulinwirkung identifiziert werden konnte. PRAS40 wirkt regulierend auf die Proteinabundanz von IRS1 und bestimmt dadurch die Insulinsensitivität. Dabei besitzt dieses Protein zwei unabhängige Funktionen in der Zelle: Auf der einen Seite wirkt PRAS40 inhibierend auf den mTORC1 Signalweg, auf der anderen Seite wird die Aktivität des Proteasoms durch PRAS40 moduliert. Zukünftige Experimente müssen jedoch den Mechanismus aufdecken, wie der Einfluss von PRAS40 auf das Proteasom vermittelt wird. According to current estimations, the worldwide prevalence of diabetes will increase from 366 million in 2011 to 552 million in 2030, emphasizing the exigency of understanding the molecular mechanisms underlying the pathophysiology of this disease in order to develop new therapeutic strategies. Both, insulin resistance in skeletal muscle, adipocytes and liver as well as β-cell dysfunction are the core pathophysiological defects in type 2 diabetes (T2D). In this context, insulin resistance in skeletal muscle represents a critical determinant in pathogenesis of T2D and occurs long before clinical symptoms are observed. However, the underlying mechanisms as well as the involved factors contributing to the progression of insulin resistance are not yet fully elucidated. Intermediates involved in insulin signaling are pleiotropic and their role in physiological and pathophysiological insulin action is often undefined. For that reason, one important issue of diabetes research is to understand the normal insulin signaling cascade as well as to identify and characterize the multiple mechanisms involved in the disturbance of insulin action in skeletal muscle. The Akt and mammalian target of rapamycin complex 1 (mTORC1) signaling pathway play a predominant role in normal control of insulin action as well as in pathophysiology of insulin resistance. Proline-rich Akt substrate of 40kDa (PRAS40), a component and substrate of mTORC1, is one of the most prominent Akt-substrates in skeletal muscle. Although insulin-mediated phosphorylation of PRAS40 is impaired in skeletal muscle of high-fat diet fed rodents and humans with T2D, its function in insulin action is incompletely understood. Due to this inadequately defined function of PRAS40 in insulin signaling, one of the aims of this thesis was to characterize the function of PRAS40 on insulin action as well as on mTORC1 signaling in skeletal muscle. Knockdown of PRAS40 inhibited insulin-mediated phosphorylation of Akt and its downstream targets and importantly, reduced insulin-stimulated uptake of glucose. In addition, activation of the mTORC1 pathway by insulin was decreased, likely due to inhibition of the PI3K/Akt/TSC2 axis. The reduction in insulin sensitivity by PRAS40 knockdown could be ascribed to a marked reduction in insulin receptor substrate (IRS) 1 protein expression. Pharmacological inhibition of p70S6K, which has been linked to IRS1 degradation, did not restore IRS1 expression and insulin sensitivity in cells lacking PRAS40. Rather, knockdown of PRAS40 elevated the activity of the 26S proteasome, and increased the mRNA expression of the E3 ligases MuRF1 and FBXO32. Pharmacological inhibition of the proteasome using MG-132 restored IRS1 abundance and insulin sensitivity in PRAS40-knockdown cells. In contrast to these results, overexpression of PRAS40 significantly increased insulin sensitivity in human skeletal muscle cells in vitro, as well as in vivo in mice muscle. Again, these effects were mediated by alterations in IRS1. Protein abundance of IRS1 was increased after PRAS40 overexpression, which was likely induced via down-regulation of the proteasome activity by PRAS40 overexpression. Importantly, these beneficial effects were independent of posttranslation modifications (more precisely phosphorylation) and binding of PRAS40 to mTORC1. In contrast, protection against hyperinsulinemia-induced insulin resistance was only observed after PRAS40 overexpression when phosphorylation of PRAS40 and/or binding to mTORC1 was feasible. These events were also indispensable for inhibition of mTORC1 signaling by PRAS40 overexpression. Furthermore, our data revealed that PRAS40 possesses a functional nuclear export sequence. Enforced nuclear accumulation of PRAS40 via mutation of this sequence resulted in decreased insulin-mediated activation of Akt as well as of mTORC1 signaling pathway in A14 fibroblasts. Finally, we and others identified phosphorylation of PRAS40 at Thr246 as a possible biomarker for insulin resistance. Sfrp5, a newly identified modulator of insulin action in human adipocytes, inhibited insulin-mediated Akt phosphorylation, which was also displayed in a reduction in the ability of insulin to induce PRAS40 phosphorylation. In summary, we could demonstrate that PRAS40 is a new modulator of insulin action via affecting IRS1 protein abundance. In this context, PRAS40 processes a dual function; on the one hand, PRAS40 regulates mTORC1 function. On the other hand, PRAS40 affects the activity of the proteasome, which is mediated in an mTORC1-independet manner. However, the underlying mechanism of PRAS40 action on the proteasomal machinery has to be elucidated in the future.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie
Dokument erstellt am:	16.01.2014
Dateien geändert am:	16.01.2014
Promotionsantrag am:	15.08.2013
Datum der Promotion:	18.12.2013