Dokument: Isolierung und funktionelle Charakterisierung neuartiger Hydrogenasen sowie synthetischer [FeS] Cluster Proteine
| Titel: | Isolierung und funktionelle Charakterisierung neuartiger Hydrogenasen sowie synthetischer [FeS] Cluster Proteine | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=25893 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20130604-131545-1 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Deutsch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Riethausen, Jana [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof. Dr. Gärtner, Wolfgang [Gutachter] Prof. Dr. Jaeger, Karl-Erich [Gutachter] | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie | |||||||
| Beschreibungen: | Zusammenfassung der Dissertation:
[NiFe] Hydrogenasen sind mikrobielle Enzyme, welche sowohl die Generation von molekularem Wasserstoff durch H+ -Reduktion als auch die Oxidation von H2 zu Protonen und Elektronen katalysieren. Somit spielen sie eine wichtige Rolle bei der Energiegewinnung der Zelle. Forschungen zur Aufklärung dieser Katalyse-Mechanismen bezwecken die Verwendung von Hydrogenasen als biotechnologischen Erzeuger von Wasserstoff, welcher als alternativer Energieträger dienen könnte. Hydrogenasen sind heterodimere Enzyme, bestehend aus einer das aktive Zentrum enthaltenden „großen“ Untereinheit und einer „kleinen“ Untereinheit, welche typischerweise drei [FeS] Cluster aufweist. Eines der größten Probleme in der Nutzung der Hydrogenasen im Bereich der „grünen Energie“ ist ihre Sauerstoffempfindlichkeit, zumindest bei vielen ihrer Vertreter. Im Rahmen dieser Dissertation wurden folgende Teilbereiche verfolgt: (i) Es wurde ein Screening nach neuartigen Hydrogenasen aus einer Umweltprobe durchgeführt, die aus einem hydrothermalen Schlot im mittelatlantischen Rücken isoliert wurde. Hierbei wurden mittels Microarray-Technik zwei neue Hydrogenasen entdeckt und aus einer Metagenombank heraus subkloniert. (ii) Desweiteren wurde die [NiFeSe] Hydrogenase aus Desulfovibrio vulgaris Miyazaki F isoliert und biochemisch sowie spektroskopisch untersucht. Diese Hydrogenase ist von besonderer Bedeutung, da sie verglichen mit anderen [NiFe] Hydrogenasen als sauerstofftoleranter beschrieben wurde und zudem eine hohe Umsatzrate aufweist. (iii) Im Hauptteil der Arbeit wurde die sauerstofftolerante [NiFe] Hydrogenase 1 aus dem hyperthermophilen Organismus Aquifex aeolicus bearbeitet. Die Sauerstofftoleranz dieses Enzyms wurde der Anwesenheit eines neuartigen Cofaktors zugeschrieben, welcher das zum aktiven Zentrum proximale [FeS] Cluster in der kleinen Untereinheit ersetzt. In den meisten Hydrogenasen findet sich hier ein [4Fe-4S] Cluster, während in A. aeolicus und –nachgewiesen- auch in anderen sauerstofftoleranten Hydrogenasen an dieser Stelle ein [4Fe-3S] Cluster mit zwei zusätzlichen Cysteinen vorhanden ist. Um diesen Cluster näher zu untersuchen, wurde der Bereich der kleinen Untereinheit, der das proximale Cluster trägt, als diskretes Protein heterolog in E. coli überexprimiert und affinitäts-chromatographisch isoliert. Zum Vergleich der Eigenschaften dieses ungewöhnlichen Clusters wurden alle Versuche auch mit einem Standard-Cluster einer sauerstoffempfindlichen Hydrogenase ([NiFe] Hydrogenase aus DvMF) durchgeführt. Unter anaeroben Bedingungen wurde der [4Fe-4S] Cluster aus DvMF erfolgreich assembliert, während aerobes Wachstum zur Formierung eines [2Fe-2S] Clusters führte. Wurden diese [2Fe-2S] Cluster nicht Sauerstoff ausgesetzt, konnten sie durch die Zugabe von Natriumdithionit zu [4Fe-4S] Clustern umgewandelt werden. Im Falle von A. aeolicus konnte auch mit verschiedenartig modifizierten Proteinen stets nur ein [2Fe-2S] Cluster gebildet werden. Dies deutet darauf hin, dass die Maturierungsmaschinerie von E. coli zwar den Großteil der Clustermaturation übernehmen kann, dass jedoch für den letzten Schritt Spezies-spezifische Chaperone benötigt werden. Die Ergebnisse der spektroskopischen Analysen wie z.B. EPR-Spektroskopie erlaubten Rückschlüsse auf die Faltung und Assemblierung der Cluster.[NiFe] hydrogenases are microbial enzymes, catalyzing either the generation of molecular hydrogen via reduction of H + or the oxidation of hydrogen with the release of protons and electrons. Therefore they play an important role in the energy generation of the cell. Research on the elucidation of these catalytic mechanisms aims at the use of hydrogenases as biotechnological producers of hydrogen, which could serve as an alternative energy carrier. [NiFe] hydrogenases are heterodimeric enzymes, consisting of a large subunit carrying the active center, and a small subunit, which typically harbors three [FeS] clusters. One of the biggest problems in employment of hydrogenases for application in “green energy” is the oxygen sensitivity of most of their representatives. The following topics were addressed in this dissertation: A screening for novel hydrogenases from an environmental sample, isolated from a hydrothermal “black smoker” in the mid-atlantic ridge, was carried out. With the use of a microarray technology, two novel hydrogenases were discovered and subcloned out of the metagenome bank. Furthermore, the [NiFeSe] hydrogenase from Desulfovibrio vulgaris Miyazaki F was isolated and biochemically as well as spectroscopically analyzed. This hydrogenase is of particular importance, as it was described as oxygen tolerant compared with other [NiFe] hydrogenases and in addition, a high turnover rate was determined for this enzyme. In the main part of this thesis, the oxygen tolerant [NiFe] hydrogenase 1 from the hyperthermophilic organism Aquifex aeolicus was investigated. The oxygen tolerance of this enzyme was attributed to the presence of a novel cofactor, which replaces the [FeS] cluster in the small subunit, proximal to the active site. In most hydrogenases a [4Fe-4S] clusters is found at this position, while in A. aeolicus and also in other oxygen tolerant hydrogenases a [4Fe-3S] cluster with two additional cysteines occupies this site. To investigate this cluster, that protein part in the small subunit, which bears the proximal cluster, was overexpressed heterologously in E. coli as a discrete protein and isolated via affinity chromatography. All experiments were carried out also with a standard cluster of an oxygen sensitive hydrogenase ([NiFe] hydrogenase from D. vulgaris Miyazaki F) to allow for a comparison of the characteristics of this unusual cluster. Under anaerobic conditions, the DvMF [4Fe-4S] cluster was successfully assembled, while aerobic growth resulted in the formation of a [2Fe-2S] cluster. If these [2Fe-2S] clusters were not exposed to oxygen, they could be converted to [4Fe-4S] clusters by the addition of sodium dithionite. In the case of Aquifex aeolicus, only a [2Fe-2S] cluster could be formed, even if the expressed proteins were modified in a wide range. This suggests that the maturation machinery of E. coli can take over most of the maturation of the A. aeolicus [FeS] cluster except for the final step, for which apparently, species-specific chaperones are required. The results of spectroscopic analyses such as EPR spectroscopy allowed inferences on the folding and assembly of the clusters. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät | |||||||
| Dokument erstellt am: | 04.06.2013 | |||||||
| Dateien geändert am: | 04.06.2013 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 02.04.2013 | |||||||
| Datum der Promotion: | 27.05.2013 |
