Dokument: FRET restrained high‐precision structural modeling of biomolecules

Titel:	FRET restrained high‐precision structural modeling of biomolecules
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=21872
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20120717-091801-5
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Sindbert, Simon [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 65,95 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 13.07.2012 / geändert 13.07.2012
Beitragende:	Prof. Dr. Seidel, Claus A. M. [Gutachter] Prof. Dr. Willbold, Dieter [Gutachter]
Stichwörter:	FRET, fluorescence spectroscopy, strcutural biology,
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 540 Chemie
Beschreibungen:	Förster Resonance Energy Transfer (FRET) is a highly distance dependent mechanism particularly useful for the quantification of distances between fluorescent dyes in the range of 20-100 Å. It can be used for measurements on the single molecule level (smFRET). Thus, structural heterogeneities and dynamic transitions in biomolecules are directly measurable under physiological conditions with high time resolution which is a large advantage over most other techniques in structural biology. However, the main limitation when using quantitative FRET measurements for structural modeling is the lack of accuracy primarily originating from the long linkers which are used to couple fluorophores to the molecules of interest. Even though interdye distances can be measured with high accuracy, translating them into structurally relevant distances between linker attachment atoms yields uncertainties in the order of magnitude of the distances accessible to FRET. Another limitation for the accuracy of FRET distances originates from the uncertainties of the orientations of the dyes which have a significant influence on the efficiency of FRET and are difficult to estimate unless fast rotational diffusion can be assumed. So far, there has been no comprehensive approach to use smFRET measurements for structural modeling which also takes linker effects into account in a meaningful way. The goal of this thesis was to establish a methodology for the generation of accurate smFRET based structural models of biomolecules. In a first step, to overcome the above mentioned problem of uncertainty due to linker effects and orientational uncertainties, it was vital to realistically describe linker and dye dynamics (translational and rotational diffusion, respectively) and model dye position distributions. To achieve this, fluorescence labeled dsDNAs and dsRNAs were chosen as model systems and the local environment and mobility of dyes was characterized through fluorescence intensity and anisotropy decay measurements for different linker types. Furthermore, it was shown that by proper consideration of accessible volumes (AVs) of fluorophores, modeled by a simple geometric algorithm for different donor and acceptor positions along a dsRNA, it is possible to accurately predict distances measured by FRET (RMSD = 1.3 Å). Also a rigorous procedure is introduced to estimate and minimize dye orientation uncertainties (κ^2-problem) which significantly contribute to the errors of measured distances. Considering the case of undefined dye environments we introduce short linkers which significantly reduce position uncertainties. A detailed analysis of possible orientation effects indicated that, for short linkers and unknown local environments, additional κ^2-related uncertainties are clearly outweighed by better defined dye positions. In a second step, a complete set of tools is introduced for smFRET based structural modeling. It includes the proper consideration of FRET distance restraints and measurement uncertainties and, furthermore, structure determination via docking of rigid bodies or screening of structural ensembles. A dramatic improvement in the precision is achieved through explicitly considering spatial distributions of dye positions, which greatly reduces uncertainties due to flexible dye linkers. Furthermore, possible solutions are evaluated and their precision estimated via bootstrapping. A DNA/DNA 19/35 primer/template (dp/dt) to HIV-1 reverse transcriptase (RT) complex was chosen as a validation system. The structure of the double stranded part of dp/dt in complex with the protein was recovered by docking rigid bodies. The model agrees with the known X-ray structure with an RMSD of 0.5 Å. Furthermore, a large structural ensemble of the flexible single stranded template overhang was created by molecular dynamics simulations and filtered with respect to agreement with FRET data yielding a preferential conformation bound to the fingers domain of RT. This might have important implications concerning proper alignment of the primer terminus within the active site, thus affecting fidelity of DNA synthesis Finally, the method was successfully tested on an RNA four-way junction (RNA4WJ) based on the hairpin ribozyme, a dynamic and heterogeneous molecule of unknown structure. 51 independent smFRET measurements were performed, the presence of one major and two minor coexisting conformers was proven and for each dataset three distances and corresponding errors were extracted and successfully assigned to the three conformers of the RNA4WJ using their distinct Mg2+-affinities. A rigid body model for each conformer was obtained by docking four dsRNA helices. The three rigid body models were refined by MD simulations and coarse grained RNA folding using FRET-restrains resulting in meaningful all-atom structural models for all conformers. A cluster analysis gives confidence levels for the proposed ensemble of rigid body models (> 99.99 %, 84 % and 97 %) and their quality was assessed via rigorous error estimation. The achieved precisions are significantly better than the uncertainty of dye position with respect to macromolecule. Förster Resonanz Energie Transfer (FRET) ist ein stark abstandsabhängiger Prozess, der besonders zur Quantifizierung von Abständen zwischen Fluoreszenzfarbstoffen im Bereich zwischen 20-100 Å geeignet ist. Da FRET auch auf Einzelmolekülebene gemessen werden kann (smFRET), sind strukturelle Heterogenität und dynamische Übergänge in Biomolekülen unter physiologischen Bedingungen direkt zugänglich und können mit einer hohen zeitlichen Auflösung gemessen werden. Dies ist ein großer Vorteil gegenüber den meisten anderen strukturbiologischen Methoden. Der größte Nachteil bei der Nutzung von FRET-Messungen zur Strukturmodellierung ist jedoch die geringe Genauigkeit, die sich aus der großen Länge der Linker zur Kopplung von Fluoreszemzfarbstoffen an Biomolekülen ergibt. Obwohl Abstände zwischen Farbstoffen sehr genau gemessen werden können, ist die strukturell relevante Distanz zwischen den Atomen, an die die Farbstofflinker gekoppelt sind mit einem Fehler behaftet, der in der Größenordnung der für FRET zugänglichen Abstände liegt. Eine zweite Limitierung der Genauigkeit bei der Abstandsbestimmung ergibt sich aus den schwer zu bestimmenden Orientierungen der Farbstoffe, die einen großen Einfluss auf die FRET-Effizienz haben können. Bislang gibt es keinen umfassenden Ansatz zur FRET-basierten Strukturmodellierung, dem eine sinnvolle Berücksichtigung von Farbstofflinkereffekten zu Grunde liegt. Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung einer Methode zur Generierung von genauen FRET-basierten Strukturmodellen von Biomolekülen. Zunächst war es wichtig das Problem der Abstandsungenauigkeiten zu lösen, die durch die Farbstofflinker und die Unsicherheit der Farbstofforientierungen verursacht werden. Hierzu ist es notwendig, die Linker- und Farbstoffdynamik (Translations- und Rotationsdiffusion) realistisch zu beschreiben und Farbstoffpositionsverteilungen möglichst genau zu modellieren. Für verschiedene Linkertypen wurden dazu Fluoreszenzintensitäts- und Anisotropiezerfälle an fluoreszenzmarkierter doppelsträngiger (ds) DNA und RNA gemessen, um die Umgebung und Mobilität der Farbstoffe zu charakterisieren. Durch die Berücksichtigung von Farbstoffpositionsverteilungen (accessible volumes, AVs), die durch einen simplen geometrischen Algorithmus modelliert wurden, konnten außerdem präzise Vorhersagen über experimentell gemessene FRET-Abstände an einer dsRNA gemacht werden. Des Weiteren wurde eine rigorose Prozedur eingeführt um die Ungenauigkeiten von Farbstofforientierungen (κ^2-Problem) abzuschätzen und zu minimieren. Die hier erstmals verwendeten kurzen Farbstofflinker eignen sich besonders für unbekannte Farbstoffumgebungen, wo AV-Modellierung nicht möglich ist. Für sie ergeben sich kleine zusätzliche Ungenauigkeiten aufgrund Orientierungsunsicherheiten. Diese werden jedoch durch die besser bestimmte Position mehr als aufgewogen. Als nächster Schritt wurde ein vollständiges Toolset zur Einzelmolekül-FRET-basierten Strukturmodellierung eingeführt. Es beinhaltet die sinnvolle Einbeziehung von gemessenen FRET-Abständen und deren Messfehlern. Des Weiteren die Strukturmodellierung durch das Docken rigider Strukturelemente oder durch „Screening“ von Strukturensembles. Durch die explizite Berücksichtigung von Farbstoffpositionsverteilungen werden Ungenauigkeiten durch Linkereffekte stark reduziert und so die Präzision der Strukturmodelle dramatisch erhöht. Die Methode beinhaltet außerdem die Evaluation möglicher Lösungen und die rigorose Bestimmung ihrer Präzision. Als Validierungssystem wurde ein Komplex aus einer DNA/DNA 19/35 primer/template (dp/dt) und der Reversen Transkiptase (RT) des HIV-1 benutzt. Die Struktur des rigiden doppelsträngigen Teils der DNA im Komplex mit dem Protein wurde durch Docken der beiden Elemente bestimmt. Die mittlere quadratische Abweichung (RMSD) zwischen der gedockten und der Röntgenkristallstruktur betrug 0.5 Å. Mit Hilfe von MD-Simulationen wurde ein großes Strukturensemble für den flexiblen einzelsträngigen Teil der DNA generiert. Anschließend wurde das Ensemble gefiltert, indem Farbstoffverteilungen modelliert wurden und die sich ergebenden FRET-Abstände mit den gemessenen verglichen wurden. Eine bevorzugte Position des Template-Einzelstrangs in der Fingerregion des Proteins konnte so bestimmt werden. Dieses Ergebnis könnte wichtige Konsequenzen für die Ausrichtung des 5‘-Endes der DNA im aktiven Zentrum des Enzyms haben und sich auf die DNA-Synthesegenauigkeit auswirken. Zuletzt wurde die Methode erfolgreich an einer RNA „four-way junction” (RNA4WJ) getestet, die auf dem Hairpinribozym basiert. Diese RNA4WJ ist ein Molekül, das dynamische Heterogenität aufweist und dessen Struktur unbekannt ist. 51 unabhängige Einzelmolekül-FRET-Messungen wurden durchgeführt und die Existenz von einem Hauptkonformer und zwei gering bevölkerten Konformeren nachgewiesen. Aus jedem Datensatz konnten drei Abstände und die dazugehörigen Fehler extrahiert und den jeweils zugehörigen Konformeren aufgrund ihrer unterschiedlichen Mg2+-Affinitäten zugeordnet werden. Für jedes Konformer konnten Strukturmodelle erstellt werden, indem vier als rigide angenommene dsRNA-Helices gedockt wurden. Diese wurden unter Berücksichtigung der FRET-Abständsbeschränkungen mit Hilfe von MD- und „coarse grained“-Simulationen verfeinert. So ergaben sich sinnvolle atomare Modelle. Für die sich ergebenden Strukturen konnten Konfidenzniveaus durch Clusteranalyse bestimmt werden. Die Präzision der jeweiligen Modelle ergab sich aus einem Bootstrappingverfahren und war jeweils um eine Größenordnung kleiner als die Ungenauigkeit die sich aus den Linkereffekten ergibt.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät
Dokument erstellt am:	17.07.2012
Dateien geändert am:	17.07.2012
Promotionsantrag am:	02.05.2012
Datum der Promotion:	02.07.2012