Dokument: Einfluss intrazellulärer Nukleotid-Cofaktoren auf Redoxreaktionen in rekombinanten Ganzzellsystemen
| Titel: | Einfluss intrazellulärer Nukleotid-Cofaktoren auf Redoxreaktionen in rekombinanten Ganzzellsystemen | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=19381 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20110930-102931-2 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Deutsch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Minör, Daniel [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof. Dr. Pietruszka, Jörg [Gutachter] PD Dr. Pohl, Martina [Gutachter] | |||||||
| Stichwörter: | Ganzzellbiotransformation, Oxidoreduktasen, Alkoholdehydrogenase, Enreduktase, Nukleotid-Cofaktoren | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie | |||||||
| Beschreibungen: | Enzymatische Reaktionen liefern eine interessante Alternative gegenüber klassisch chemischen Synthesewegen. In den letzten Jahren hat daher die Produktion von chiralen Bausteinen mit Hilfe von Enzymen zugenommen. So können Oxidoreduktasen beispielsweise für Redoxreaktionen eingesetzt werden. Dabei können die Enzyme sowohl in isolierter Form als auch im Ganzzellsystem eingesetzt werden. Durch die Abhängigkeit der Oxidoreduktasen von kostenintensiven Cofaktoren wie NAD(P)H erhöhen sich die Produktionskosten beim Einsatz von isolierten Enzymen, da hier die Cofaktoren zugesetzt werden müssen. Dies kann durch die Verwendung von Ganzzellsystemen umgangen werden. Da die Cofaktoren innerhalb der Reaktion stöchiometrisch verbraucht werden, muss auch innerhalb der Ganzzellbiotransformation ein Regenerierungssystem implementiert werden. Die Regenerierung der Cofaktoren kann Substrat-gekoppelt erfolgen, wobei die Produktion und Regenerierung durch ein Enzym katalysiert wird, oder Enzym-gekoppelt, wobei zwei Enzyme notwendig sind. In den letzten Jahren wurden Ganzzellbiotransformationen reaktionstechnisch ausführlich charakterisiert und optimiert, jedoch ist wenig über die an der Reaktion beteiligten Cofaktoren sowie deren Stabilität und Verfügbarkeit bekannt.
In dieser Arbeit wurde die Cofaktorstabilität und -verfügbarkeit mit Hilfe von zwei Ganzzellsystemen untersucht, einem Substrat-gekoppeltem System mit einer Alkoholdehydrogenase (LbADH) aus Lactobacillus brevis und einem neu etablierten System mit einer Enreduktase (ER) aus Saccharomyces carlsbergensis in Verbindung mit der LbADH. Die sehr kurze Halbwertszeit des Cofaktors ist der hauptsächlich limitierende Faktor bei Prozessen mit langer Laufzeit. Für das LbADH-System wurde das untere Limit der Cofaktorkonzentration zum Zeitpunkt der Umsatzabnahme bei kontinuierlichen Prozessen identifiziert. Hingegen ließ sich die Cofaktorverfügbarkeit durch die Umsetzung im Satzverfahren erhöhen. Es konnte gezeigt werden, dass die Substrat-gekoppelte Cofaktorregenerierung in diesem System auch bei geringen Cofaktorkonzentrationen effektiv erfolgte und ein gewisser Verlust an intrazellulären Cofaktoren zu Gunsten höherer Produktkonzentrationen akzeptiert werden kann. Das ER/LbADH-System wurde für die asymmetrische Reduktion eines Nitroacrylates in kontinuierlichen Reaktionen und im Satzverfahren in Verbindung mit Isopropanol für die Cofaktorregenerierung genutzt. Während ein rapider Verlust an intrazellulären Cofaktoren innerhalb der kontinuierlichen Reaktion beobachtet wurde, konnte deren Verfügbarkeit im Satzverfahren erhöht werden. Die beobachtete Abnahme an Cofaktoren innerhalb der kontinuierlichen Reaktion war im Vergleich zum LbADH-System deutlich stärker ausgeprägt. Das detailliertere Wissen über die limitierenden Einflüsse der Cofaktoren auf Ganzzellbiotransformationen kann nun genutzt werden, um industrielle Anwendungen ökonomischer zu gestalten. Die Ergebnisse zeigen, dass vor allem bei Enzym-gekoppelten Systemen eine sehr feine Abstimmung der Reaktionsbedingungen für eine effektive Cofaktorregenerierung und somit für einen hohen Umsatz essentiell ist. Da der Verlust an intrazellulären Cofaktoren ein komplexer Prozess ist, bedingt durch die organischen Substrate und Produkte sowie der Reaktionszeit, müssen die Einflüsse dieser Parameter für jedes Ganzzellsystem vor der Maßstabsvergrößerung erneut getestet werde.Enzymatic reaction systems performed under mild reaction conditions represent an interesting alternative to multistep chemical routes. In the recent years, the use of enzyme-catalyzed reactions for the production of chiral building blocks has significantly increased. Oxidoreductases are often used for such reactions, either as isolated enzymes or in whole cell systems. These enzymes require cofactors, such as NAD(P)H, which have to be added to the reaction system in case of isolated enzymes. This increases the production costs, which can be avoided by using intracellular cofactors of whole cell systems. A recycling system needs to be implemented in the whole cell system to cope with the stoichiometric consumption of the cofactor within the reaction. This can be accomplished by a substrate-coupled regeneration system, in which one enzyme catalyzes the production and the regeneration reaction, or an enzyme-coupled regeneration system, in which two enzymes are required. In the past, whole cell biotransformation systems have been intensively characterized and optimized with regard to reaction engineering, but only little information is available on the involved cofactors, their stability and availability within the reaction. In this thesis, the cofactor stability and availability has been investigated using two reaction systems: a substrate-coupled whole cell system using an alcohol dehydrogenase from Lactobacillus brevis (LbADH) and a new established enzyme-coupled whole cell reaction system using an ene reductase (ER) from Saccharomyces carlsbergensis together with the LbADH. For the LbADH system the lower limit of necessary cofactor concentration for this reaction was identified at the timepoint of decreasing conversion. The very short shelf life of the cofactors is the main limiting factor for long-term processes. In contrast, the availability of the cofactors for redox reactions could be increased by reducing the reaction time in case of a batch reaction mode. It was obvious that the substrate-coupled cofactor regeneration is very effective, even at low cofactor levels and that a certain loss of cofactor, using higher concentrations of substrates in batch reactions, is acceptable leading in higher product yields. The ER/LbADH system was applied for the asymmetric reduction of nitroacrylate, using isopropanol as substrate for cofactor regeneration in continuous- and batch reaction modes. While a rapid loss of intracellular cofactors could be observed in the continuous reaction, their stability and availability could again be increased by applying a batch reaction mode. The decrease in cofactors in the continuous reaction was even more pronounced compared to the LbADH system. The more detailed knowledge of the limiting influences, caused by decreasing intracellular cofactor concentrations, can now be used to make large scale or industrial applications of whole cell systems economically more feasible. The presented results show that especially for enzyme-coupled approaches a fine-tuned adjustment of the reaction conditions is essential for effective cofactor regeneration to achieve high conversions. The loss of intracellular cofactors is a complex process, encompassing the influence of organic substrates and products and the reaction time, thus these parameters should be tested for every whole cell system before upscale. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät | |||||||
| Dokument erstellt am: | 30.09.2011 | |||||||
| Dateien geändert am: | 30.09.2011 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 19.04.2011 | |||||||
| Datum der Promotion: | 06.07.2011 |
