Dokument: Autodisplay von Nitrilasen zur Umsetzung von Nitrilen zu Carbonsäuren
| Titel: | Autodisplay von Nitrilasen zur Umsetzung von Nitrilen zu Carbonsäuren | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=16978 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20110131-090516-7 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Deutsch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Detzel, Christian [Autor] | |||||||
| Dateien: |
| |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften » 610 Medizin und Gesundheit | |||||||
| Beschreibungen: | Zusammenfassung:
Im Rahmen dieser Arbeit wurde die putative Nitrilase aus Saccharomyces cerevisiae (NitSc), die Nitrilase aus Klebsiella pneumoniae subsp. ozaenae (NitKp) und die Nitrilase aus Alcaligenes faecalis subsp. faecalis (NitAf) als Autodisplay-Passagiere auf der Zelloberfläche von Escherichia coli präsentiert. Die Oberflächenständigkeit der Passagierdomäne der erzeugten Autodisplay-Fusionsproteine NitSc-AT, NitKp-AT und NitAf-AT konnte mittels Proteasezugänglichkeitstest nachgewiesen werden. Für das lediglich aufgrund von Sequenzhomologien zur Enzymklasse der Nitrilasen zählende Enzym NitSc ist bisher noch kein Substrat bekannt. Zum Nachweis einer Nitrilaseaktivität wurde deshalb eine repräsentative Auswahl an aliphatischen, aromatischen und arylaliphatischen Verbindungen als Substrat getestet. Mit der getroffenen Auswahl war es für NitSc-AT tragende E. coli BL21(DE3) Zellen nicht möglich eine Nitrilaseaktivität nachzuweisen. Demgegenüber konnte für NitKp-AT tragende E. coli BL21(DE3) Zellen eine Nitrilaseaktivität nachgewiesen werden. Dabei akzeptierte NitKp-AT, wie das freie Enzym NitKp, Bromoxynil, Chloroxynil und Ioxynil als Substrat. Desweiteren konnte für NitKp-AT das Substratspektrum mit 3-Fluor-4-hydroxybenzonitril und 3,5-Dimethyl-4-hydroxybenzonitril auch auf fluorierte und nichthalogenierte Verbindungen ausgeweitet werden, die bisher noch nicht als Substrate für das freie Enzym NitKp beschrieben wurden. Durch die Expression des Autotransporter Fusionsproteins NitAf-AT in E. coli BL21(DE3) konnte zum ersten Mal das Autodisplay eines multihomomeren Enzyms gezeigt werden, das aus bis zu 14 identischen Untereinheiten bestehen kann. Der erzeugte Ganzzell-Biokatalysator akzeptierte Phenylacetonitril und Mandelsäurenitril als Substrat, wobei Phenylacetonitril fünf Mal schneller umgesetzt wurde als Mandelsäurenitril. Die bei 37 °C erzeugte Mandelsäure wies einen Enantiomeren-überschuss von 99,2 % für das R-Enantiomer auf. Nach fünf zyklisch wiederholten 24-stündigen Umsetzungen in Tris-HCl pH 7 bei 30 °C konnte eine Restaktivität von 58 %, bezogen auf die Mandelsäureproduktion im ersten Reaktionszyklus, nachgewiesen werden. Der mit Mandelsäurenitril als Substrat für NitAf-AT ermittelte Km-Wert lag in der gleichen Größenordnung wie der aus der Literatur bekannte Km-Wert für das freie Enzym NitAf. Bei der Kultivierung von NitAf-AT tragenden Zellen im Fermenter konnte eine maximale Trockenzellmasse von 6,8 g L−1 erzielt werden. Die nachfolgende Umsetzung von Mandelsäurenitril zu R-Mandelsäure im Fermenter führte zu einer durchschnittlichen Raum-Zeit-Ausbeute von 0,31 g L-1 d-1 Mandelsäure. Im Vergleich zur Umsetzung mit Schüttelkolben¬kulturen bedeutete dies eine Verdopplung der Mandelsäure¬produktion. Der Enantiomeren¬überschuss für die im Fermenter bei 45 °C erzeugte R-Mandelsäure lag bei 95,8 %. Somit konnte zum ersten Mal die generelle Eignung eines Autodisplay-Ganzzell-Biokatalysators zur Kultivierung im Fermenter sowie der anschließenden Umsetzung von Mandelsäurenitril im 2 L-Maßstab belegt werden.Summary: In this work a putative nitrilase from Saccharomyces cerevisiae (NitSc), a nitrilase from Klebsiella pneumoniae subsp. ozaenae (NitKp) and a nitrilase from Alcaligenes faecalis subsp. faecalis (NitAf) were displayed as Autodisplay-passengers on the surface of E. coli. The surface exposure of the passenger domain of the constructed Autodisplay fusion proteins NitSc-AT, NitKp-AT und NitAf-AT was verified by protease accessibility tests. Previous studies have not yet reported a substrate for the enzyme NitSc, which was assigned to the enzyme class of nitrilases based on sequence similarity. Therefore a representative selection of aliphatic, aromatic and arylaliphatic compounds was tested as substrates, however it was not possible to detect any nitrilase activity for E. coli BL21(DE3) cells displaying NitSc-AT. In contrast, nitrilase activity could be detected for E. coli BL21(DE3) cells displaying NitKp-AT. NitKp-AT accepted Bromoxynil, Chloroxynil and Bromoxynil as substrates, as did the free enzyme. Furthermore, NitKp-AT was also able to convert 3-Fluor-4-hydroxybenzonitril and 3,5-Dimethyl-4-hydroxybenzonitril, which were so far not described as substrates for the free enzyme NitKp. With the expression of NitAf-AT in E. coli BL21(DE3) this study represents the first successful surface display of a multihomomeric enzyme, which composed of up to 14 subunits. The constructed whole-cell biocatalyst accepted phenylacetonitrile as well as mandelonitrile as substrate, hydrolyzing phenylacetonitrile approximately five times faster than mandelonitrile. The mandelic acid produced at 37 °C showed an enantiomeric excess of 99.2 % for the R-enantiomer. After five 24 h cycles of repeated use in Tris-HCl pH 7 at 30 °C the whole-cell biocatalyst showed a residual activity of 58 % in comparison with the first cycle. The Km for NitAf-AT was calculated to be between 2.75-3.64 mM, depending on cell density and therefore within the same magnitude as the reported Km (5.75 mM) for the free enzyme NitAf. The cultivation of NitAf-AT displaying cells in a bioreactor yielded a maximal dry cell weight of 6.8 g L−1. Subsequent conversion of mandelonitrile to R-mandelic acid led to an average space-time yield of 0.31 g L-1 d-1, almost double the yield achieved with shaking flask cultures. The enantiomeric excess for the R-mandelic acid produced at 45 °C was determined to be 95.8 %. These results show for the first time the general suitability of an Autodisplay whole-cell biocatalyst for cultivation in a bioreactor for conversion of mandelonitrile in a 2 L scale. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Pharmazie » Pharmazeutische und Medizinische Chemie | |||||||
| Dokument erstellt am: | 31.01.2011 | |||||||
| Dateien geändert am: | 31.01.2011 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 27.11.2010 | |||||||
| Datum der Promotion: | 13.12.2010 |
