Dokument: Die periplasmatische [FeFe]-Hydrogenase aus Desulfovibrio desulfuricans ATCC 7757: Aufreinigung, Kristallisation, spektroskopische und elektrochemische Charakterisierung

Titel:	Die periplasmatische [FeFe]-Hydrogenase aus Desulfovibrio desulfuricans ATCC 7757: Aufreinigung, Kristallisation, spektroskopische und elektrochemische Charakterisierung
Weiterer Titel:	The periplasmic [FeFe] hydrogenase from Desulfovibrio desulfuricans ATCC 7757: purification, crystallization, spectroscopic and electrochemical characterization
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=16965
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20110126-105419-8
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Diplom-Biologe Wenk, Brian [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 14,56 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 05.01.2011 / geändert 05.01.2011
Beitragende:	Prof. Dr. Lubitz, Wolfgang [Gutachter] Prof. Dr. Jaeger, Karl-Erich [Gutachter]
Stichwörter:	Hydrogenase, Desulfovibrio desulfuricans
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	In dieser Arbeit wurde die periplasmatische [FeFe]-Hydrogenase DdH aus dem sulfatreduzierenden Bakterium Desulfovibrio desulfuricans ATCC 7757 chromatographisch aufgereinigt, kristallisiert und mit den Mitteln der EPR-Spektroskopie und Elektrochemie untersucht. Die Enzymklasse der Hydrogenasen katalysiert die Synthese von Wasserstoff bzw. dessen heterolytische Spaltung. Das Verständnis der genauen Funktionsweise dieses Katalyse-Prozesses ist von besonderem Interesse, da man hofft, aus dieser grundlegende Erkenntnisse für eine zukünftige biotechnologische Wasserstoffproduktion zu gewinnen. Der [FeFe]-Hydrogenase aus Desulfovibrio desulfuricans kommt dabei die Rolle eines „Modellenzyms“ für diese Klasse zu. Bisher bekannt sind die Kristallstrukturen des Enzyms inklusive des grundlegenden Aufbaus seines katalytischen Zentrums. Im ersten Teil dieser Arbeit wird ein optimiertes Aufreinigungsprotokoll für die periplas-matische [FeFe]-Hydrogenase wiedergegeben, welches eine zeitliche und präparative Vereinfachung des bisherigen Protokolls darstellt und zu hochreinem Probenmaterial führt. Im spektroskopischen Teil dieser Arbeit werden Fragestellungen zu Struktur und katalytischer Aktivität des aktiven Zentrums der [FeFe]-Hydrogenase behandelt. Die Natur des Brückenliganden, welcher die beiden Eisenatome des als H-Kluster bezeichneten katalytischen Zentrums miteinander verbindet, konnte mittels der Impuls-EPR-Methode HYSCORE aufgeklärt und als Stickstoffatom identifiziert werden. In der ursprünglichen Strukturanalyse war dieses Atom als Kohlenstoffatom charakterisiert worden. Die Natur des Brückenliganden ist von großer Bedeutung für die verschiedenen Modelle zum Reaktionsmechanismus. In der Kristallstruktur der [FeFe]-Hydrogenase (CpI) aus Clostridium pasteurianum wurde als weiterer Ligand des distalen Eisenatoms ein Wassermolekül aufgelöst. Dieses Wassermolekül konnte bisher nicht identifiziert werden in der Kristallstruktur von DdH aus D. desulfuricans. Um das Vorhandensein oder Fehlen des Wassermoleküls an der wahrscheinlichen Bindungsstelle des aktiven Zentrums zu überprüfen, wurden Isotopenmarkierungen mit D2O durchgeführt und das Enzym danach in den oxidierten Zustand gebracht. Die anschließenden Messungen wurden mit der Doppelresonanzmethode ENDOR (electron nuclear double resonance) ausgeführt, welche es erlaubt, die Elektron-Kern-Hyperfeinkopplungen der eingebrachten Isotope zu detektieren. Die erhaltenen Kopplungen geben einen Hinweis auf Wassermoleküle in der Nähe des katalytischen Zentrums. Um genauere Informationen über die Elektronenspindichte und deren Verteilung im Bereich des aktiven Zentrums zu gewinnen, wurde dieses mit dem Isotop 13C markiert. Die Markierung wurde mit 13CO-Gas durchgeführt, durch welches die natürlichen CO-Liganden des aktiven Zentrums ausgetauscht wurden. Dabei wurde ein Effekt ausgenutzt, welcher in der Literatur als „Umverteilung“ (engl.: Scrambling) beschrieben wird. Wird die Probe bei 275 K für längere Zeit belichtet, werden die CO-Liganden gegeneinander ausgetauscht. Somit konnte die Probe durch Belichtung bei gleichzeitiger Begasung mit 13CO-Gas markiert werden. Die Hyperfeinkopplungen der CO-Liganden wurde mittels cw-EPR, HYSCORE- und Davies-ENDOR-Experimenten analysiert. Ein Teil der gewonnenen Proben wurde erfolgreich für Kristallisationsversuche eingesetzt. Die erhaltenen Kristallisationsbedingungen unterscheiden sich von den bisher bekannten und liefern Kristalle von definierten Kristallformen und Größen. Die [FeFe]-Hydrogenase aus D. desulfuricans wurde erfolgreich mit den Mitteln der Elektrochemie untersucht. Im Unterschied zu vorherigen Messungen konnte hierbei zum ersten Mal eine kovalente Bindung des Enzyms mittels eines Kopplungsagens’ an die Messelektrode erreicht werden. Die vorgenommenen Messungen erlauben einen detaillierten Blick auf das Inaktivierungs- und Reaktivierungsverhalten des Enzyms sowie dessen Inhibierung durch Sauerstoff und Kohlenmonoxid. Hydrogenases catalyse the synthesis of molecular hydrogen and its heterolytic cleavage. It is of particular interest to understand how the catalytic process exactly works as one can hope to obtain fundamental insight for a future biotechnological hydrogen production. The [FeFe] hydrogenase from Desulfovibrio desulfuricans can be considered a “model enzyme” of this class. The crystal structure of the enzyme is known providing basic structural knowledge about its catalytic centre. In this work the periplasmic [FeFe] hydrogenase DdH from the sulphate reducing bacterium Desulfovibrio desulfuricans ATCC 7757 was purified, crystallised and investigated by means of EPR-spectroscopy and electrochemistry. In the first part of this work an optimised purification protocol for the periplasmic [FeFe] hydrogenase is presented which represents a temporal and preparative simplification of current literature protocols and leads to highly homogeneous sample material. In the spectroscopic part of this work questions concerning the structure and catalytic activity of the active centre of the hydrogenase are addressed. The nature of the bridge between the two irons of the catalytic centre known as H-cluster is of profound importance for the different models of the catalytic mechanism. In the original structural analysis this atom had been assigned as a carbon atom. Hereon different working groups discussed the probabilities for nitrogen, carbon or oxygen as the central atom of the bridging ligand. The nature of the bridging ligand could be clarified by applying the pulsed EPR method HYSCORE and was identified as a nitrogen atom. In the crystal structure of the [FeFe] hydrogenase (CpI) from Clostridium pasteurianum a water molecule as a further ligand of the distal iron atom of the H-cluster was identified. This water molecule could not be found in the crystal structure of DdH from Desulfovibrio desulfuricans. In order to check if a water molecule at the binding site of the active centre is present or not the protein was labelled with D2O following ENDOR (electron nuclear double resonance) measurements. This allowed for the detection of the electron-nuclear hyperfine couplings of the incorporated isotopes. The couplings measured suggest that water molecules are present in the vicinity of the catalytic centre. In order to obtain more detailed information about the electron spin density and its distribution in the H-cluster labelling with 13C was done. Upon illumination at 275 K over longer periods of time the CO ligands interchange. On the basis of this effect it was possible to label the sample. The hyperfine couplings of the CO ligands were analysed by conducting cw-EPR-, HYSCORE- and Davies-ENDOR-experiments. The labelling was carried out with 13CO gas, with which the natural CO ligands were exchanged. In order to do that an effect known as “scrambling” was utilised . A fraction of the protein samples was successfully used for crystallisation experiments. The obtained crystals differ from crystals form the [FeFe] hydrogenase DdH both in size and shape. The [FeFe] hydrogenase DdH from Desulfovibrio desulfuricans was also investigated using electrochemical experiments. In contrast to previous measurements a covalent bonding of the enzyme to the measuring electrode was achieved for the first time by using a coupling agent. In the designed measurements the inactivation and reactivation of the enzyme was studied together with the inhibition by oxygen and carbon monoxide.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät
Dokument erstellt am:	26.01.2011
Dateien geändert am:	26.01.2011
Promotionsantrag am:	22.10.2010
Datum der Promotion:	29.11.2010