Dokument: Biotransformationen mit Cytochrom P450 Monooxygenasen

Titel:	Biotransformationen mit Cytochrom P450 Monooxygenasen
Weiterer Titel:	Biotransformations with Cytochrome P450 Monooxygenases
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=13859
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20100125-104840-8
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Zehentgruber, Daniela [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 4,60 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 20.01.2010 / geändert 20.01.2010
Beitragende:	Prof. Dr. Pietruszka, Jörg [Gutachter] PD Dr. Pohl, Martina [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 540 Chemie
Beschreibungen:	Da Cytochrom P450 Monooxygenasen (P450, CYP) die Hydroxylierung von C-H Verbindungen ermöglichen, die häufig regio- und stereoselektiv verlaufen, sind diese Enzyme von großem Potential für die industrielle Biotechnologie. Aufgrund der geringen Aktivität und Stabilität dieser Enzyme, sowie deren Sauerstoff- und Redoxcofaktor-abhängigkeit beschränkt sich der Einsatz dieser Enzyme jedoch hauptsächlich auf Anwendungen im Labormaßstab. Zusätzlich benötigen die meisten P450 weitere Protein-komponenten die den Elektronentransport vom NAD(P)H zur P450 sicherstellen. Im Rahmen dieser Arbeit sollte anhand drei verschiedener P450s ein grundlegendes Verständnis für die biotechnologische Anwendung von P450 erlangt werden. Anhand von Parameterstudien sollten die limitierenden Faktoren der einzelnen Biotransformation identifiziert werden und durch geeignete reaktionstechnische Maßnahmen überwunden werden. Bei der CYP102A1 aus Bacilllus megaterium handelt es sich um eine der wenigen P450, die keine weiteren Komponenten zum Elektronentransfer benötigt. Eine Variante dieses Enzyms wurde gemeinsam mit der Formiatdehydrogenase aus Mycobacterium vaccae 10 oder einer Alkoholdehydrogenase aus Lactobacillus brevis in Escherichia coli exprimiert und die Hydroxylierung von β-Jonon zu 4-Hydroxy-β-jonon untersucht. Neben einer starken Produktinhibierung wurde eine begrenzte Chemoselektivität des Enzyms beobachtet, da das gewünschte Produkt 4-Hydroxy-β-jonon von der CYP102A1 zum entsprechenden Keton weiteroxidiert wird. Dabei akzeptiert die CYP102A1 bevorzugt das (R)-Enantiomer als Substrat, sodass der Enantiomerenüberschuss während der Reaktion sinkt. Durch die Wahl geeigneter Reaktionsbedingungen konnte unter Zugabe von Dimethylsulfoxid ein Enantiomerenüberschuss von 72 % für das (R)-Enantiomer erreicht werden. Darüber hinaus konnte eine Produktivität von 1,25 g L-1 d-1 und eine TTN von 5000 für die P450 erzielt werden. Der rekombinante Spalthefestamm Schizosaccharomyces pombe CAD 18 exprimiert die humane Steroidhydroxylase CYP21, wobei der Elektronentransport von der Spalthefe-eigenen FAD/FMN abhängigen Cytochrom P450 Reduktase übernommen wird. Anhand der Hydroxylierung von 17α-Hydroxyprogesteron zu 11-Desoxycortisol wurde die CYP21 eingehend auf potentielle Limitierungen untersucht. Dabei wurde sowohl die Substratlöslichkeit als auch der Substrattransport in die Zelle als reaktionslimitierend identifiziert. Durch den Einsatz vom permeabilisierten Zellen in Gegenwart von 5 vol% Methanol konnte die Produktivität im Vergleich zu Lieraturwerten verdoppelt werden. Bei der CYP106A2 aus B. megaterium handelt es sich um eine der wenigen bekannten bakteriellen Steroidhydroxylasen. Dieses Enzym konnte bereits gemeinsam mit den Elektronentransferkomponenten Adrenodoxin und Adrenodoxinreduktase erfolgreich in E .coli exprimiert werden. Zusätzlich wurde eine enzymgekoppelte Cofaktorregenerierung durch Expression der Alkoholdehydrogenase aus L. brevis realisiert und die 15β-Hydroxy-lierung von Progesteron und Testosteron untersucht. Genau wie bei der CYP21 katalysierten Steroidhydroxylierung limitiert der Substrattransport über die Membran die Ganzzellbiotransformation, die durch die Verwendung von Zellrohextrakt als Biokatalysator überwunden werden konnte. Der Redoxcofaktor der im Rohextrakt vorhanden ist, reicht für eine effiziente Hydroxylierung aus, sodass auf eine Zugabe des kostenintensiven Redoxcofaktor verzichtet werden konnte. Unter optimierten Bedingungen wurde eine Produktivität von 3,7 g L-1 d-1 bzw. 5,5 g L-1 d-1 für die Synthese von 15β-OH-Progesteron bzw. 15β-OH-Testosteron erreicht, was einer 18fachen Steigerung im Vergleich zu den Literaturwerten entspricht. Außerdem wurde eine Methode zur Produktaufarbeitung entwickelt, die neben der quantitativen Produktabtrennung auch eine Wiederverwendung des Biokatalysators erlaubt. Cytochrome P450 monooxygenases (CYP, P450) are heme containing, ubiquitous enzymes that enable the hydroxylation of C-H bonds, often in a regio- and stereoselective manner. Due to this ability they are of tremendous interest for the synthesis of fine chemicals and pharmaceuticals. However, low activity, limited stability, oxygen- and NAD(P)H-dependency restrict these enzymes mainly to lab scale applications. Furthermore most P450s require additional components such as a cytochrome P450 reductase and an iron sulphur protein to enable the electron transfer from the NADPH to the P450. Within this PhD project three different P450s were studied to identify the bottlenecks of these valuable enzymatic reactions. Afterwards a concept should be provided to overcome the limitations of each biotransformation and to make these reactions more feasible for potential industrial applications. As an example for a self sufficient P450, that contains all components necessary for hydroxylation (reductase + heme domain) on a single polypeptide chain, the well-known CYP102A1 from Bacillus megaterium was chosen and the conversion of β-ionone to 4-hydroxy-β-ionone was studied. Therefore an Escherichia coli strain was constructed, that expresses a variant of this P450 together with formate dehydrogenase from Mycobacterium vaccae 10 or alcohol dehydrogenase from Lactobacillus brevis to implement an enzyme coupled cofactor regeneration. Besides a strong product inhibition only a limited chemoselectivity was observed. The desired product 4-hydroxy-β-ionone is overoxidized by the CYP102A1 to the corresponding ketone. As the (R)-enantiomer was not only formed in favour, but also turned out to be the preferred substrate for the overoxidation, a drop in the enantiomeric excess over the reaction time was observed. By adding dimethyl sulfoxide to the reaction medium and optimizing the reaction conditions, the enantiomeric excess could be increased up to 72 % in favour for (R)-4-hydroxy-β-ionone. Thereby a volumetric productivity of 1.25 g L-1 d-1 and a TTN of 5 000 for the P450 was achieved. The recombinant fission yeast strain Schizosaccharomyces pombe CAD 18 expresses the human CYP21, a steroid-21-hydroxylase. This enzyme obtains the reduction equivalents necessary for hydroxylation from the reductase of the host organism. To identify the bottlenecks of this P450 catalyzed reaction the conversion of 17α-hydroxyprogesterone to 11-deoxycortisol was studied. Thereby substrate solubility and the substrate transport over the membrane turned out to be crucial. By adding 5 vol% methanol to the reaction media and by using permeabilized cells as biocatalyst, productivity could be doubled compared to previously reported results. CYP106A2 from B. megaterium is one of a few known bacterial steroid hydroxylases. This enzyme has already been successfully expressed in E. coli together with the electron transfer partners bovine adrenodoxin and adrenodoxin reductase. Additionally an enzyme coupled cofactor regeneration system was implemented by expression alcohol dehydrogenase from L. brevis and progesterone and testosterone conversion was studied. Again, substrate transport over the membrane limited the whole cell biotransformation. As no membrane associated enzymes were involved in the reaction, the transport limitation could be overcome by using crude cell extract as biocatalyst. Due to a high NADP+ concentration in the crude cell extract, addition of the expensive redox cofactor could be avoided. In batch reactors under optimized conditions the productivity of progesterone and testosterone conversion could be increased up to 18-fold, yielding an absolute productivity for 15β-OH-progesterone and 15β-OH-testosterone formation of 3.7 g L-1 d-1 and 5.5 g L-1 d-1 respectively. Product extraction with adsorber resins allowed not only the recovery of quantitative amounts of 15β-OH-progesterone and 15β-OH-testosterone but also the reuse of the biocatalyst.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Chemie » Bioorganische Chemie
Dokument erstellt am:	25.01.2010
Dateien geändert am:	20.01.2010
Promotionsantrag am:	08.10.2009
Datum der Promotion:	30.11.2009