Dokument: [FeFe]-Hydrogenase-Maturasen und Acetat:Succinat-CoA-Transferase in den Hydrogenosomen des mikroaerophilen Humanparasiten Trichomonas vaginalis

Titel:	[FeFe]-Hydrogenase-Maturasen und Acetat:Succinat-CoA-Transferase in den Hydrogenosomen des mikroaerophilen Humanparasiten Trichomonas vaginalis
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=9967
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20081219-121446-0
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Rosnowsky, Silke [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 2,56 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 18.12.2008 / geändert 18.12.2008
Stichwörter:	Trichomonas vaginalis, Hydrogenosom, Hydrogenase, ASCT
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Trichomonas vaginalis ist ein humanpathogener, mikroaerophiler Flagellat, der Hydrogenosomen, eine anaerobe Form der Mitochondrien, besitzt. In den Hydrogenosomen wird Pyruvat zu Acetat, H2, CO2 und ATP metabolisiert. Im Gegensatz zu Mitochondrien erfolgt die ATP-Produktion ausschließlich über Substratkettenphosphorylierung. Die Bildung von Acetat ist abhängig von der Acetat:Succinat-CoA-Transferase (ASCT), während H2 über Elektronenübertragung durch eine [FeFe]-Hydrogenase auf H+ entsteht. In einer Proteomanalyse von Hydrogenosomen aus T. vaginalis wurde eine mögliche ASCT identifiziert. Dieses Protein ist ein Homologes der Acetyl-CoA-Hydrolase/Transferase Proteinfamilie, zeigt jedoch keine Ähnlichkeiten zu der bereits charakterisierten ASCT aus Mitochondrien von Trypanosoma brucei. Das identifizierte Gen einer ASCT aus T. vaginalis wurde erfolgreich kloniert und homolog in T. vaginalis und heterolog in CHO K1-Zellen exprimiert. Die heterologe Expression der TvASCT in CHO K1-Zellen zeigte eine geringe Aktivität. Die homologe Überexpression in T. vaginalis erhöhte den RNA- und Protein-Gehalt der TvASCT sowie die ASCT-Aktivität etwa 4-fach. Das Protein wurde über eine N-terminale Transitsequenz und Zellfraktionierung eindeutig als hydrogenosomales Enzym identifiziert. Damit wurde das letzte bisher fehlende Enzym des Pyruvat-Stoffwechsels in T. vaginalis Hydrogenosomen charakterisiert. Die Reifung der [FeFe]-Hydrogenasen unterscheidet sich von dem bereits aus Bakterien bekannten Mechanismus der [NiFe]-Hydrogenasen. Im Genom von T. vaginalis wurden homologe Sequenzen zu den bereits in Chlamydomonas reinhardtii beschriebenen Maturase-Genen hydE, hydG und hydF identifiziert. Die Proteinsequenzen für HydE, HydF und HydG sind innerhalb der Eukaryoten hoch konserviert und in allen Organismen mit [FeFe]-Hydrogenasen zu finden. In T. vaginalis sind diese in den Hydrogenosomen lokalisiert. In dieser Arbeit konnte nun gezeigt werden, dass auch in T. vaginalis die Aktivität von [FeFe]-Hydrogenasen von der Co-Expression mit Maturasen abhängig ist. Fällt die Synthese der Komponenten des H-Clusters, der sich im aktiven Zentrum des Enzyms befindet, durch Deletion eines der beteiligten Maturase-Gene aus, scheint dies für T. vaginalis nicht kompensierbar zu sein. Eine Deletion von hydG bzw. hydF wäre somit letal. Im Gegensatz zu Metronidazol-resistenten T. vaginalis Stämmen, in denen der hydrogenosomale Pyruvat-Metabolismus vermindert ist, führt die Inaktivierung der [FeFe]-Hydrogenase zum Verlust des terminalen Elektronenüberträgers und Elektronen können nicht auf H+ übertragen und damit als H2 aus der Zelle entfernt werden. Trichomonas vaginalis is a microaerophilic flagellate which possesses hydrogenosomes, anaerobic forms of mitochondria. Hydrogenosomal pyruvate metabolism results in the endproducts acetate, H2, CO2 and ATP. In contrast to mitochondria, ATP production in hydrogenosomes occurs exclusively via substrate level phosphorylation. Formation of acetate depends on acetate:succinate-CoA-transferase (ASCT) whereas H2 is generated by electrontransfer of [FeFe]-hydrogenase to H+. A possible ASCT was identified by analysis of the hydrogenosomal proteome. The ASCT is a homolog of the acetyl-CoA-hydrolase/transferase protein family, but shares no similarity to the recently characterized ASCT from Trypanosoma brucei mitochondria. The putative ASCT gene from T. vaginalis was successfully cloned. Heterologous expression of TvASCT in CHO K1 cells resulted in low ASCT activities whereas homologous overexpression in T. vaginalis showed a more than 4-fold increase of TvASCT RNA and protein levels and also ASCT activity. The TvASCT gene contains a N-terminal targeting signal. The localization of the ASCT protein in the hydrogenosomes was clearly demonstrated. In this work it could be proven that this protein functions as the missing ASCT of T. vaginalis, the last missing enzyme of hydrogenosomal pyruvate metabolism. Maturation of [FeFe]-hydrogenases differs from the known bacterial mechanism of [NiFe]-hydrogenase maturation. Homologs of [NiFe]-hydrogenase maturation genes (hyp-genes) were not found in organisms bearing [FeFe]-hydrogenases. In the T. vaginalis genome homologs to sequences of accessory genes necessary for maturation of the Chlamydo-monas reinhardtii [FeFe]-hydrogenase were identified. Protein sequences of HydE, HydF and HydG are higly conserved among organisms with [FeFe]-hydrogenases. In T. vaginalis these proteins are localized in hydrogenosomes. In this work it was demonstrated, that activity of T. vaginalis [FeFe]-hydrogenases is dependent on co-expression with the maturases HydE, HydF and HydG. T. vaginalis seems to be unable to survive the loss of the hydG or hydF genes. Deletion of hydG and hydF, respectively, seems to be lethal. In contrast to metronidazole-resistant T. vaginalis strains where hydrogenosomal pyruvate metabolism is absent, the inactivation of hydrogenases causes loss of the terminal electron carrier, and electrons cannot be transmitted to H+ to be removed from the cell as H2.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät
Dokument erstellt am:	19.12.2008
Dateien geändert am:	18.12.2008
Promotionsantrag am:	06.11.2008
Datum der Promotion:	15.12.2008