Dokument: Untersuchung der Expression und Regulation der KIR Gene im Rahmen der Differenzierung humaner Natürlicher Killerzellen
| Titel: | Untersuchung der Expression und Regulation der KIR Gene im Rahmen der Differenzierung humaner Natürlicher Killerzellen | |||||||
| Weiterer Titel: | Analysis of the expression and regulation of KIR genes during human NK cell differentiation | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=9799 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20081209-112650-8 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Deutsch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Dr. Sribar, Martina [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof. Dr. Uhrberg, Markus [Betreuer/Doktorvater] Prof. Dr. Wagner, Rolf [Gutachter] | |||||||
| Stichwörter: | NK-Zellen, KIR, HLA | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie | |||||||
| Beschreibungen: | Natürliche Killerzellen (NK-Zellen) sind große und granuläre Lymphozyten, die zum angeborenen Immunsystem gehören. Sie repräsentieren etwa 10 % der Lymphozyten im peripheren Blut und übernehmen wichtige Funktionen bei der Abwehr und Lyse von virusinfizierten Zellen und Tumorzellen. NK-Zellen exprimieren MHC-Klasse-I-spezifische Rezeptoren auf ihrer Zelloberfläche, die sich Killer Immunglobulin-like Receptors (KIRs) nennen. KIRs sind sehr polymorph und werden klonal auf NK-Zellen exprimiert. KIR-Rezeptoren können sowohl stimulatorisch als auch inhibitorisch auf die NK-Zelle wirken und damit ggf. die Lyse der Zielzelle einleiten. In der vorliegenden Arbeit wurde die Expression der KIR-Rezeptoren im Zuge der NK-Zellentwicklung untersucht. Es wurde ein in vitro Modell zur NK-Zelldifferenzierung etabliert, anhand dessen hämatopoetische Progenitor-zellen in NK-Zellen differenziert werden konnten. Dabei wurden im zeitlichen Verlauf der NK-Zellentwicklung Zellproben entnommen und hinsichtlich ihrer KIR-Expression untersucht. Zum einen wurde die KIR-Expression mit sequenzspezifischen Gensonden mittels RT-PCR analysiert und gleichzeitig wurden die Zellen mit KIR-spezifischen fluoreszenzkonjugierten Antikörpern phänotypisch untersucht. Die generierten Daten zeigen eine Korrelation von Expressions- und phänotypischen Analysen. Anhand dieser Resultate konnte aufgezeigt werden, dass die verschiedenen KIR-Gene in einer sequentiellen Art und Weise exprimiert werden, bei der zuerst KIR2DL4, dann KIR2DL3 und anschließend, abhängig vom jeweiligen Genotyp, weitere KIR-Gene aktiviert und dann auf der Oberfläche exprimiert werden.
Weiterhin wurden epigenetische Analysen der heranreifenden NK-Zellen durchgeführt, die bei der Behandlung mit demethylierenden (AZA) und chromatinöffnenden (TSA) Substanzen eine zusätzliche Induktion der KIR-Rezeptoren zeigten. Es konnten mittels Real-Time-PCR epigenetisch wichtige Enzyme charakterisiert werden, die im Verlauf der NK-Zelldifferenzierung verstärkt exprimiert werden. Dabei handelt es sich um DNA-Methyltransferasen (DNMT3A1, DNMT3L), Histondeacetylasen (HDAC4, HDAC9) sowie den Transkriptionsfaktor RUNX3 und dessen Korepressor TLE1. Zusätzlich wurde die Chromatinstruktur der KIR-Promotoren mittels ChIP-Assays untersucht. Dabei wurden Antikörper verwendet, die spezifisch für euchromatische (H4K8, H3K4) und heterochromatische (H3K9, H3K27) Modifikationen der Histone H3 und H4 waren. Aufgrund der Relation von euchromatischen zu heterochromatischen Histonmodifikationen konnte in der NK-Zelldifferenzierung folgende Reihung von bereits offener zu noch geschlossener Chromatinstruktur der untersuchten KIR-Promotoren beobachtet werden: 2DL4 > 2DL3 > 3DL1 > 2DL1, was wiederum mit den bereits generierten Daten zur sequentiellen KIR-Expression übereinstimmt.Natural Killer (NK) cells are large granular lymphocytes that belong to the innate immune system. They represent a subpopulation between 10 % and 15 % of the human lymphocytes. NK cells are important mediators of virus- and tumour-specific immune responses. In humans, the killer cell Ig-like receptors (KIRs) contribute to this form of immunosurveillance by recognizing different subsets of HLA class I molecules on their target cells. Each NK cell expresses an individual subset of inhibitory and stimulatory KIRs and contributes to a diversified NK cell repertoire. In this study KIR expression during NK cell differentiation was examined. An in vitro model could be established by culturing hematopoietic progenitor cells and differentiating them into NK cells. During this time course of differentiation, samples of proliferating cells were harvested and analyzed with regard to their KIR expression. Samples were analyzed by RT-PCR using sequence-specific primers. Simultaneously, a phenotypical analysis concerning the expressed KIR on the cell surface was carried out by flow cytometry with KIR specific antibodies. The data reveal a correlation between the expressed KIR receptors on mRNA (RT-PCR) and protein level (flow cytometry). The results show a sequential expression of the different KIR genes where KIR2DL4 is expressed first followed by KIR2DL3. Subsequently other KIR genes were detected depending on the KIR genotype of the respective sample. Moreover, epigenetic analysis of the KIR locus during NK cell proliferation and commitment were made using DNA demethylating (AZA) and chromatin remodelling (TSA) agents, where an additional induction of KIR expression could be observed. With real-time-PCR, some epigenetically important enzymes were detected, which are suggested to play a role in NK cell differentiation as they were expressed stronger than others. The candidates are DNA methyltransferases (DNMT3A1, DNMT3L), histone deacetylases (HDAC4, HDAC9) and the transcription factor RUNX3 and its corepressor TLE1. Furthermore, the chromatin structure of the KIR promoters was analyzed by ChIP assays using antibodies specific for euchromatic (H4K8, H3K4) and heterochromatic (H3K9, H3K27) status, looking for the modifications of this histones. By taking the ratio of the two opposing histone modifications, H4K8 as active mark and H3K9 as repressive mark a hierarchy was detectable from an open to a still closed chromatin structur revealing following order: 2DL4 > 2DL3 > 3DL1 > 2DL1. These results are in turn consistent with the already generated data of the sequential KIR expression. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie | |||||||
| Dokument erstellt am: | 09.12.2008 | |||||||
| Dateien geändert am: | 03.12.2008 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 22.01.2008 | |||||||
| Datum der Promotion: | 22.01.2008 |
