Dokument: Nutzung heterologer Transporter zur Steigerung der L-Threoninbildung mit Corynebacterium glutamicum

Titel:	Nutzung heterologer Transporter zur Steigerung der L-Threoninbildung mit Corynebacterium glutamicum
Weiterer Titel:	Usage of heterologous transporter to improve L-threonine accumulation by Corynebacterium glutamicum
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=9765
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20090127-094006-4
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Diesveld, Ramon [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 1,83 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 01.12.2008 / geändert 01.12.2008
Beitragende:	Prof. Dr. Sahm, Hermann [Gutachter] Prof. Dr. Schmitt, Lutz [Gutachter]
Stichwörter:	heterologe Transporter; Threonin; Corynebacterium glutamicum; RhtC; RhtA
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Auf Grund ihrer Funktion des Substrat- und Produkt-Transports sind Transporter an den elementarsten Prozessen der Zelle beteiligt. Bei biotechnologischen Anwendungen ist häufig der Export der limitierende Schritt. Ziel dieser Arbeit war es, Transportprozesse bei Corynebacterium glutamicum zu untersuchen und durch Nutzung heterologer Transporter gezielt die Exportlimitierung bei der L-Threonin-Produktion zu beseitigen. Zusätzlich zur zellulären Synthese von Aminosäuren sind auch Transportprozesse für die mikrobielle Aminosäurebildung relevant. Insbesondere erfordert massive Aminosäuresynthese eine entsprechend hohe Exportleistung der Zelle. Neben dem Einsatz globaler Transkriptomanalysen war es das herausragende Ziel dieser Arbeit zu untersuchen, ob durch Nutzung heterologer Transporter die Exportlimitierung bei der L-Threonin-Produktion mit Corynebacterium glutamicum beseitigt werden kann. Es konnte gezeigt werden, dass L-Aspartat, L-Serin und L-Threonin zusammen mit Glukose aufgenommen werden. Durch globale Transkriptomanalysen wurde aber kein eindeutiger Hinweis auf die an der Aufnahme beteiligten Transporter erhalten. Dagegen wurde eine bisher unbekannte transkriptionelle Regulation der Gene glyA und serA durch L-Serin entdeckt. Von den vier untersuchten Exportern RhtA, RhtB, RhtC und YeaS aus Escherichia coli konnte gezeigt werden, dass RhtA und RhtC effektiv in Corynebacterium glutamicum den L-Threonin Export katalysieren. Während im Ausgangsstamm zellintern bis zu 140 mM L-Threonin akkumulieren, wird durch den RhtC bedingten Export die zellinterne Konzentration auf 10 mM erniedrigt. Für RhtC konnte eine Exportrate von 8,9 nmol min-1 mg TG-1 und für RhtA eine von 5,8 nmol min-1 mg TG-1. bestimmt werden. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass RhtA neben L-Threonin auch L-Serin exportieren kann. Zusätzlich zum Export wurde durch Metabolic Engineering des Stoffwechsels eine gesteigerte L-Threoninbildung im Stammhintergrund Corynebacterium glutamicum DM1800 pEC-T18 homfbr thrB thrE pEKEx2 rhtC erreicht: Inaktivierung der Threonin-Dehydratase führte zu einer Steigerung von 20%, verstärkte Transkription der Pyruvat-Carboxylase um 5% und Reduktion der Citrat-Synthase Aktivität um 15%. Die maximal erreichte Exportrate war 13,3 nmol min-1 mg TG-1 und die maximale extrazelluläre Akkumulation betrug 66 mM L-Threonin mit einer Ausbeute von 0,3 mol pro mol Glukose. Gegenüber dem anfangs vorliegenden Stamm beträgt die Steigerung 900%. Aufgrund des Produktspektrums, sowie der internen Konzentrationen, ist davon auszugehen, dass der Export von L-Threonin durch Nutzung des heterologen Transporters RhtC in Corynebacterium glutamicum nun nicht mehr limitierend ist. Transporters take part in the most essential processes of the cell due to their function in substrate and product transport. In biotechnological applications export is often the limiting step. The main objective of this thesis was to analyze transport processes in Corynebacterium glutamicum and to overcome export limitations in L-threonine production by the use of heterologous transporters. Although the amino acids L-aspartate, L-serine and L-threonine are co-consumed together with glucose, transcriptome analysis did not reveal any distinct indication of increased expression of the amino acid importers involved in the uptake. However, a hitherto unknown transcriptional regulation of the genes glyA and serA encoding for serine hydroxymethyltransferase and 3-phosphoglycerate dehydrogenase by L-serine was discovered. Of the four analyzed transporters RhtA, RhtB, RhtC and YeaS from Escherichia coli the two transporters RhtA and RhtC could effectively catalyze the export of L-threonine in C. glutamicum. Whereas the use of peptides without expression of RhtC led to the accumulation of up to 140 mM of cell-internal L-threonine, the cell-internal concentration was reduced to a maximum of 10 mM due to RhtC-mediated export. Under these conditions a maximal export rate of 8.9 nmol min-1 mg TG-1 was determined for RhtC and of 5.8 nmol min-1 mg TG-1 for RhtA. Moreover, it was shown that RhtA also exports L-serine in addition to L-threonine. In addition to the export, increased L-threonine accumulations were achieved in the strain background of C. glutamicum DM1800 pEC-T18 homfbr thrB thrE pEKEx2 rhtC. Inactivation of the threonine dehydratase resulted in a rise of 20%, increased transcription of the pyruvate carboxylase by 5% and reduced citrate synthase activity by 15%. The maximal export rate obtained was 13.3 nmol min-1 mg TG-1 and the maximal accumulation of L-threonine was 66 mM with a yield of 0.3 mol L-threonine per mol glucose. This is a 900% increase compared to the strain present at the beginning of this thesis. Due to the product spectrum and the internal concentration it can therefore be assumed that by using the heterologous transporter RhtC the export of L-threonine is no longer limiting.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie
Dokument erstellt am:	27.01.2009
Dateien geändert am:	01.12.2008
Promotionsantrag am:	14.10.2008
Datum der Promotion:	03.11.2008