Dokument: Die erste R-selektive Hydroxynitril-Lyase mit α/β-Hydrolasefaltung - Charakterisierung biochemischer Eigenschaften und Struktur-Funktionsbeziehungen -
| Titel: | Die erste R-selektive Hydroxynitril-Lyase mit α/β-Hydrolasefaltung - Charakterisierung biochemischer Eigenschaften und Struktur-Funktionsbeziehungen - | |||||||
| Weiterer Titel: | The first R-selective hydroxynitrile lyase with an α/β-hydrolase fold - Characterization of biochemical properties and structure function relationships - | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=8930 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20080925-091025-4 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Deutsch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Andexer, Jennifer N. [Autor] | |||||||
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| Stichwörter: | Hydroxynitril-Lyase, Cyanhydrine, asymmetrische Carboligation | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie | |||||||
| Beschreibungen: | Hydroxynitril-Lyasen (HNLs) katalysieren die enantioselektive Spaltung von Cyan-hydrinen. In der technischen Biokatalyse werden die C-C-Bindungs-knüpfenden Enzyme zur Synthese von chiralen Cyanhydrinen eingesetzt. Bisher sind verschiedene HNLs aus Pflanzen isoliert worden, die sich strukturell und mechanistisch in verschiedene Gruppen einteilen lassen. Die HNLs aus Hevea brasiliensis und Manihot esculenta gehören zur Familie der α/β-Hydrolasen und dienten als Ausgangspunkt für eine sequenzbasierte Suche nach neuen HNLs. Im Genom der Modellpflanze Arabidopsis thaliana wurden über 20 ähnliche uncha-rakterisierte Sequenzen gefunden, sieben davon wurden kloniert und heterolog in Escherichia coli exprimiert.
Mit einem für Hochdurchsatzanwendungen neu entwickelten Aktivitätstest wurden die potenziellen Enzyme bezüglich der Spaltung von verschiedenen Cyanhydrinen un-tersucht. Die bei einem der Enzyme beobachtete HNL-Aktivität bestätigte sich in der Synthesereaktion. Im nächsten Schritt wurde das neue Enzym (AtHNL) aufgereinigt, biochemisch charakterisiert und in Zusammenarbeit mit dem Institut für Technische Chemie an der Universität Rostock hinsichtlich der Synthese verschiedenster Cyan-hydrine untersucht. Das neue Enzym erwies sich dabei überraschenderweise als R-selektiv hinsichtlich der Synthese und Spaltung von Cyanhydrinen. Dies ist bemer-kenswert, da die S-Selektivität bisher als eines der charakteristischen Merkmale von HNLs mit α/β-Hydrolasefaltung galt. Ein breites Substratspektrum und gute Stabilität unter Reaktionsbedingungen sind wichtige Eckpunkte für die Beurteilung der Eignung eines Biokatalysators für die technische Anwendung. Im Hinblick auf das Substratspektrum ist die AtHNL ver-gleichbar mit den bereits in technischen Prozessen eingesetzten HNLs, allerdings zeigt sie insbesondere im sauren pH-Bereich geringere Stabilität. Um die Unterschiede in der Stereoselektivität zu verstehen und eine Basis für die Verbesserung des Enzyms mittels rationalem Design zu erhalten, wurde die Struktur der AtHNL in Kooperation mit der Abteilung für Strukturbiologie der Universität Graz röntgenkristallographisch mit einer Auflösung von 2,5 Å gelöst. Aufgrund von Do-ckingstudien wurde ein im Vergleich zu den homologen Enzymen abgewandelter Reaktionsmechanismus vorgeschlagen, der in ersten Experimenten mit Punktmutationen experimentell verifiziert werden konnte.Hydroxynitrile lyases (HNLs) catalyze the enantioselective cleavage of cyanohydrins. Due to their ability to form C-C bonds these enzymes are technically used for the synthesis of optically active cyanohydrins. So far, different HNLs have been isolated from plants. These HNLs can be divided in various groups depending on their structure and mechanism. In a sequence-based approach, the HNLs from Hevea brasiliensis und Manihot esculenta, belonging into the group of α/β-hydrolases, were used as starting enzymes for the identification of novel HNLs. In the genome of the model plant Arabidopsis thaliana over 20 uncharacterized sequences were found. Seven of them were cloned and heterologously expressed in Escherichia coli. All enzymes were tested for their HNL-activity against various cyanohydrin substrates in a newly developed assay system which is also applicable for high-throughput screening. For one enzyme the observed HNL-activity was subsequently verified in the synthetic reaction. Additionally, the new enzyme (AtHNL) was purified and bio-chemically characterized. In a collaboration with the Department of Technical Chem-istry (University of Rostock) the synthesis of different cyanohydrins was examined. Interestingly, the enzyme is strictly R-selective whereas until now, S-selectivity was a characteristic property of HNLs with an α/β-hydrolase fold. A broad range of substrates and good stability under reaction conditions are impor-tant for the use of enzymes as biocatalysts in technical approaches. Concerning the substrate range, AtHNL is comparable with other HNLs, already used in technical processes. However, the AtHNL shows some differences in stability, especially con-cerning acidic pH ranges. To understand the reversed enantioselectivity and to create a model for rational de-sign, the structure of the enzyme was elucidated by x-ray-crystallography with a 2.5 Å resolution. This work was done in collaboration with the institute for structure biology at the University of Graz. Based on docking-studies a reaction mechanism differing from the homologous enzymes MeHNL and HbHNL could be proposed .The catalytic mechanism could be verified in initial experiments with point mutations. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Enzymtechnologie | |||||||
| Dokument erstellt am: | 25.09.2008 | |||||||
| Dateien geändert am: | 10.09.2008 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 09.11.2007 | |||||||
| Datum der Promotion: | 14.01.2008 |
