Dokument: Molekularbiologische und biochemische Untersuchungen zur Biosynthese von Mycotoxinen aus Aspergillus fumigatus

Titel:Molekularbiologische und biochemische Untersuchungen zur Biosynthese von Mycotoxinen aus Aspergillus fumigatus
Weiterer Titel:Molecular biological and biochemical investigations of mycotoxin biosynthesis in Aspergillus fumigatus
URL für Lesezeichen:https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=8388
URN (NBN):urn:nbn:de:hbz:061-20080714-092413-3
Kollektion:Dissertationen
Sprache:Deutsch
Dokumententyp:Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:Text
Autor: Grundmann, Alexander [Autor]
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Dateien vom 08.07.2008 / geändert 08.07.2008
Beitragende:Prof. Dr. Li, Shu Ming [Betreuer/Doktorvater]
Prof. Dr. Proksch Peter [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:Aspergillus fumigatus ist ein opportunistisch pathogener Schimmelpilz, der eine Reihe biologisch aktiver Sekundärmetabolite produziert. Dazu zählen u.a. die Fumitremorgine. Hierbei handelt es sich um mehrfach prenylierte, zyklische Dipeptide, die sich von L-Tryptophan und L-Prolin ableiten. Einige der biosynthetischen Vorstufen von Fumitremorgin B zeigen pharmazeutisch interessante biologische Aktivitäten. Die Tryprostatine A und B unterbrechen den Zellzyklus von Zellen in der M-Phase und sowohl Tryprostatin A als auch Fumitremorgin C hemmen das BCRP (breast cancer resistance protein), einen ABC-Transporter, der Brustkrebszellen eine Multidrugresistenz gegenüber Zytostatika verleiht. Ein Ziel der vorliegenden Arbeit war die Aufklärung der Biosynthese von Fumitremorgin B.
Ein putatives Biosynthesegencluster von Fumitremorgin B wurde in der Genom-sequenz von A. fumigatus Af293 identifiziert. Das putative Gencluster ist 25 kb groß und enthält 10 ORFs. Sequenzanalyse und Vergleich der Gene aus dem Cluster mit Datenbankeinträgen ermöglichte die Postulierung eines hypothetischen Biosyntheseweges für Fumitremorgin B.
Der experimentelle Beweis für die Identität des Clusters von Fumitremorgin B aus A. fumigatus wurde durch heterologe Überexpression der beiden Prenyltransferasegene ftmPT1 (=AFUA_8G00210) und ftmPT2 (=AFUA_8G00250) in Escherichia coli bzw. in Saccharomyces cerevisiae erbracht. Die Enzyme FtmPT1 und FtmPT2 wurden als His-tag Proteine überproduziert und mit Hilfe einer Nickel-NTA-Affinitätssäule zur Homogenität gereinigt. Nach Inkubation der Fusionsproteine mit Brevianamid F bzw. 12,13-Dihydroxyfumitremorgin C in Gegenwart von Dimethylallyldiphosphat (DMAPP) wurden die enzymatischen Produkte über HPLC isoliert und mittels NMR- und LC-MS-Analyse identifiziert.
Es konnte gezeigt werden, dass FtmPT1 die Prenylierung von Brevianamid F am C-2 des Indolkörpers zu Tryprostatin B katalysiert und somit für den zweiten Schritt in der Biosynthese von Fumitremorgin B verantwortlich ist. Der letzte Schritt der Biosynthese, die Prenylierung von 12,13-Dihydroxyfumitremorgin C am Indolstickstoff, wird durch die zweite Prenyltransferase FtmPT2 katalysiert.
Zur biochemischen Charakterisierung der beiden Enzyme wurden die kinetischen Parameter, die Ionenabhängigkeit und die Substratspezifität untersucht. Die enzymatischen Reaktionen folgten jeweils der Michaelis-Menten-Kinetik.
FtmPT1 war aktiv als Monomer, die Km-Werte für Brevianamid F und DMAPP betrugen 55 bzw. 77 µM. Die maximale Reaktionsgeschwindigkeit betrug 104 nmol*Sek-1*mg-1 und ergab damit eine Wechselzahl von 5.57 Sek-1.
FtmPT2 war aktiv als Homodimer und die Km-Werte für 12,13-Dihydroxy-fumitremorgin C und DMAPP betrugen 96 bzw. 186 µM. Die maximale Reaktions-geschwindigkeit betrug 15 nmol*Min-1*mg-1 und ergab damit eine Wechselzahl von 0.03 Sek-1.
FtmPT1 und FtmPT2 erwiesen sich als unabhängig von divalenten Metallkationen, denn selbst bei Anwesenheit von EDTA, einem Komplexbildner für zweiwertige Ionen, zeigten sie keine Verringerung ihrer enzymatischen Aktivitäten.
Sowohl FtmPT1 als auch FtmPT2 akzeptierten ausschließlich DMAPP als Prenyldonor. Gegenüber seinen aromatischen Substraten zeigte sich FtmPT1 flexibel. Das Enzym akzeptierte auch andere tryptophan-haltige, zyklische Dipeptide.

Desweiteren wurde die Zyklisierung von Tryprostatin A zu Fumitremorgin C bzw. von Tryprostatin B zu Demethoxyfumitremorgin C untersucht. Es konnten die zwei Gene ftmP (=AFUA_8G00280) und ftmOx1 (=AFUA_8G00240) heterolog in E. coli exprimiert werden. Allerdings konnte für beide überproduzierte Enzyme bis zu diesem Zeitpunkt keine Aktivität nachgewiesen werden.
In Kooperation mit Prof. Turner in Sheffield wurde das Gen ftmPS (=AFUA_8G00170) aus A. fumigatus Af293 untersucht, das für eine nicht-ribosomale Peptidsynthetase codiert. Es wurde vermutet, dass das Genprodukt von ftmPS an der Biosynthese von Fumitremorgin B beteiligt ist.
Durch Überexpression von ftmPS in A. fumigatus Af293 und anschließende Analyse der Sekundärstoffe mittels HPLC, NMR und LC-MS konnte gezeigt werden, dass FtmPS den ersten Schritt der Biosynthese von Fumitremorgin B katalysiert, die Kondensation von L-Tryptophan und L-Prolin zum zyklischen Dipeptid Brevianamid F.
Zusätzlich konnte das Gen psoA (=AFUA_8G00540) für die Mycotoxinproduktion von A. fumigatus Af293 in Zusammenarbeit mit Prof. Turner identifiziert werden. Durch Inaktivierung und nachfolgender Überexpression des Gens für ein PKS/NRPS-Hybridenzym, und durch Sekundärstoffanalyse mit HPLC, NMR und LC-MS konnte seine Beteiligung an der Biosynthese von Pseurotin A nachgewiesen werden.

Aspergillus fumigatus is an opportunistic pathogenic fungus that produces a variety of interesting biologically active substances including the fumitremorgins. Fumitremorgins are prenylated cyclic dipeptides derived from L tryptophan and L prolin. Some biosynthetic precursors of fumitremorgin B show interesting biological activities, e.g. the tryprostatins A and B are cell cycle inhibitors and tryprostatin A as well as fumitremorgin C are able to inhibit the BCRP (breast cancer resistance protein). One aim of this work was the investigation of the biosynthesis of fumitremorgin B.
A putative biosynthetic gene cluster of fumitremorgin B could be identified in the genome sequence of A. fumigatus Af293. This gene cluster has a size of 25 kb and comprises 10 ORFs. By sequence analysis and by comparison of the putative genes with entries in databases, it was possible to postulate a hypothetical biosynthetic pathway for fumitremorgin B.
Experimental evidence of the identity of this gene cluster was provided by heterologous overexpression of two prenyltransferase genes ftmPT1 (=AFUA_8G00210) and ftmPT2 (=AFUA_8G00250) in E. coli and S. cerevisiae, respectively. Both gene products were overproduced as His-tag fusion proteins und purified to homogeneity by Ni-NTA affinity chromatography. The recombinant proteins were incubated with brevianamide F and 12,13-dihydroxyfumitremorgin C respectively, in the presence of dimethylallyldiphosphate (DMAPP). The enzymatic products were isolated on HPLC and structure elucidation was carried out by NMR- and MS-analysis.
It could be shown that FtmPT1 catalyses the prenylation of brevianamide F at C-2 of the indole moiety to give tryprostatin B, which represents the second step in the biosynthesis of fumitremorgin B. The last step of the biosynthesis, the N-prenylation of 12,13-dihydroxyfumitremorgin C is catalysed by the second prenyltransferase, FtmPT2.
For biochemical characterization, kinetic parameters, dependence on metal ions and substrate specificities were investigated. Both enzyme reactions followed Michaelis-Menten-kinetics. FtmPT1 was active as a monomer. Km values for brevianamide F und DMAPP were determined as 55 and 77 µM, respectively. The maximal reaction velocity was 104 nmol*sec-1*mg-1, corresponding to a turnover number of 5.57 sec-1.
FtmPT2 was active as a homodimer. Km values for 12,13-dihydroxyfumitremorgin C and DMAPP were determined as 96 and 186 µM, respectively. The maximal reaction velocity was 15 nmol*min-1*mg-1, corresponding to a turnover number of 0.03 sec-1.
FtmPT1 and FtmPT2 were independent of divalent metal ions and even in the presence of EDTA no loss of enzymatic activity could be observed.
Both enzymes accepted only DMAPP as prenyl donor. FtmPT1 showed substrate flexibility towards its aromatic substrate and accepted various tryptophan-containing cyclic dipeptides.
Furthermore, the cyclisation of tryprostatin A to fumitremorgin C or from tryprostatin B to demethoxyfumitremorgin C was investigated. Two genes, ftmP (=AFUA_8G00280) and ftmOx1 (=AFUA_8G00240), that may be involved in this step of the biosynthesis, were heterologously overexpressed in E. coli. For both gene products, no enzymatic activity could be observed yet.
In cooperation with Prof. Turner in Sheffield the function of the gene ftmPS (=AFUA_8G00170) encoding for a non-ribosomal peptide synthetase was investigated. This gene could be shown to be responsible for the first step of the biosynthesis of fumitremorgin B, the condensation of L-tryptophan and L-proline to the cyclic dipeptide brevianamide F. Overexpression of ftmPS in A. fumigatus Af293 led to the production of a substance that could be unequivocally identified by NMR and MS analysis as brevianamide F.
In another cooperation project with Prof. Turner in Sheffield, the function of a gene from A. fumigatus Af293 encoding a PKS/NRPS hybrid enzyme was investigated. Analysis of the secondary metabolites after overexpression of this gene showed that the PKS/NRPS hybrid enzyme is involved in the biosynthesis of the mycotoxin pseurotin A.
Rechtliche Vermerke:Aus patentrechtlichen Gründen bis 31.07.2009 gesperrt
Fachbereich / Einrichtung:Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Pharmazie » Pharmazeutische Biologie und Biotechnologie
Dokument erstellt am:03.08.2009
Dateien geändert am:08.07.2008
Promotionsantrag am:10.06.2008
Datum der Promotion:07.07.2008
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