Dokument: Einfluss des Lipase-spezifischen Chaperons LipH auf die Faltung und Sekretion der Lipasen LipA und LipC aus Pseudomonas aeruginosa

Titel:	Einfluss des Lipase-spezifischen Chaperons LipH auf die Faltung und Sekretion der Lipasen LipA und LipC aus Pseudomonas aeruginosa
Weiterer Titel:	Influence of the lipase-specific foldase LipH on folding and secretion of the lipases LipA and LipC of Pseudomonas aeruginosa
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=8308
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20080703-092743-7
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Hausmann, Sascha [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 27,16 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 01.07.2008 / geändert 01.07.2008
Beitragende:	Prof. Dr. Jaeger, Karl-Erich [Gutachter] Prof. Dr. Willbold, Dieter [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Mikrobielle Lipasen finden in der organischen Chemie und in der Biotechnologie durch ihre Stabilität in organischen Lösungsmitteln und aufgrund der Tatsache, dass sie keine Cofaktoren benötigen, breite Verwendungsmöglichkeiten. Sie katalysieren eine Vielfalt von Reaktionen. Zum Beispiel werden sie neben der Verwendung als Detergenzersatz in Waschmitteln dazu eingesetzt, mehrfach ungesättigte Fettsäuren für die Lebensmittelindustrie, Biopolymere, Biodiesel aus Pflanzenölen und enantiomerenreine Grundbausteine für die Pharmaindustrie herzustellen. Aufgrund der definierten industriellen Reaktionsbedingungen werden häufig Anstrengungen unternommen, die Enzyme hinsichtlich ihrer Stabilität, Aktivität und Enantioselektivität z. B. durch das Prinzip der gerichteten Evolution zu optimieren. Der Sequenzraum, in dem diese für Lipasen durchgeführt werden kann, wenn eine homologe Expression aktiver und extrazellulärer Lipase angestrebt wird, ist jedoch aufgrund der essentiellen Interaktionen mit der Vielzahl akzessorischer Proteine begrenzt. Hingegen gestaltet sich die heterologe Expression von Lipasen durch die Komplexität der zellulären Ereignisse im homologen Wirt kompliziert. Durch das Fehlen der akzessorischen Komponenten aggregieren die Enzyme intrazellulär und bilden inaktive „inclusion bodies“ aus, die eine Renaturierung unter Einsatz der jeweiligen Lipase-spezifischen Foldase nötig machen. Aus diesen Gründen sollte die Effizienz der Expression und Reinigung aktiver P. aeruginosa Lipase nach heterologer Expression gesteigert werden. Durch die Entfernung des für die Translokation über die innere Membran essentiellen Signalpeptids und die Optimierung des verwendeten Mediums konnte die Ausbeute und Reinheit der Lipase LipA erhöht werden. In diesem Expressionssystem gelang es erstmals, die zweite in P. aeruginosa identifizierte Lipase LipC in für eine Charakterisierung des Enzyms geeigneten Mengen zu gewinnen. Die vermutete Interaktion der Lipase-spezifischen Foldase LipH mit LipC konnte erstmalig in vitro nachgewiesen werden. Somit stellt LipH das erste Lif-Protein dar, für das beschrieben werden konnte, dass es mehr als eine Lipase in die aktive Konformation überführen kann. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass diese Lipase, trotz ihrer hohen Homologie zu LipA und ähnlicher Eigenschaften während der in vitro Faltung wie Ca2+- und Glycerol-Abhängigkeit, ein breiteres Spektrum an Substraten als LipA akzeptiert, und dass die Kavität, die zum aktiven Zentrum führt, im Strukturmodell ein größeres Volumen aufweist. Das Signal, welches die Sekretion von Proteinen über die äußere Membran während der Typ-II Sekretion vermittelt, konnte trotz intensiver Forschung aufgrund der großen Diversität der sekretierten Proteine bislang nicht identifiziert werden. Es konnte gezeigt werden, dass die Translokation von LipC in das Medium, trotz der hohen Homologie zu LipA, nicht über die „klassische“ Transportmaschinerie durchgeführt wird. Aufgrund der hohen Homologie von LipA und LipC konnten durch vergleichende Analysen Strukturbereiche identifiziert werden, die in LipA und den weiteren aufgeklärten, über diese Transportmaschinerie sekretierten Proteinen, vorhanden sind, aber in LipC Unterschiede aufweisen. Eine Mutagenese dieses putativen Teils des Sekretionssignals in LipA resultierte in einer Veränderung der Effizienz der Sekretion der Enzyms, so dass mit diesen Resten potentiell ein Teil des gemeinsamen Sekretionssignals, welches den Typ-II abhängigen Transport in das Medium vermittelt, identifiziert werden konnte. Die Lipasevariante 1H8, deren Enantiopräferenz gegen 2-MDA-pNP durch gerichtete Evolution von E=1.1 auf E=51 für das (S)-Enantiomer verändert wurde, konnte im homologen Wirt nicht mit zufriedenstellender Ausbeute produziert werden. Als Grund konnte eine Beeinträchtigung der Sekretion ermittelt werden. Durch Untersuchung der Sekretionseffizienz der entsprechenden Einzelvarianten konnten zwei der insgesamt sechs Mutationen als für den Sekretionsdefekt verantwortlich identifiziert werden, die beide nicht in der Enantioselektivität der Lipasevariante involviert sind. Die hohe Affinität, die Lipasen gegenüber ihren spezifischen Foldasen aufweisen, konnte dazu genutzt werden, eine neue Strategie für die Reinigung heterolog exprimierter Lipase aus „inclusion bodies“ zu etablieren. Dieses Vorgehen vereint die Vorzüge einer Affinitätsreinigung mit der gleichzeitigen in vitro Renaturierung und Immobilisierung des Biokatalysators, und ermöglicht erstmals eine einfache Reinigung, die unabhängig von den jeweiligen Eigenschaften der zu produzierenden Lipase ist. Dabei sind die katalytischen Eigenschaften des Enzyms unabhängig von dem Bindungszustand zu seinem Chaperon. So konnte auch LipA 1H8, dass bei homologer Expression nicht in großen Mengen produziert werden konnte, durch dieses Verfahren nach heterologer Expression in elektrophoretischer Homogenität mit guter Ausbeute gereinigt werden, wobei es weiterhin die gleiche Enantioselektivität wie LipA 1H8 aus dem Kulturüberstand von P. aeruginosa aufwies. Durch die hohe Affinität und die große Interaktionsfläche von LipA und LipH konnte keine Möglichkeit gefunden werden, die Dissoziation des Proteinkomplexes zu initiieren. Lif-Proteine weisen starke Analogien zu intramolekularen Chaperonen, sog. Propeptiden, von Proteasen auf. In silico Untersuchungen ergaben, dass in allen betrachteten Operons eine translationale Fusion aus Lipase und Foldase durch eine Punktmutation generiert werden kann. Diese Fusion wurde für lipAH aus P. aeruginosa erstellt und homolog exprimiert, wobei lipolytische Aktivität im Kulturüberstand detektiert werden konnte. Diese beruhte jedoch auf spezifischer Proteolyse, wobei die entstandenen LipA- und LipH-Fragmente des prozessierten Fusionsproteins wie nach Expression von Wildtyp lipAH lokalisiert waren. In E. coli hingegen trat diese Prozessierung nicht auf. Somit erscheint es weiterhin denkbar, dass die Gene der Lipase und der Foldase früher ein Gen waren und erst im Laufe der Evolution getrennt wurden. Bislang sind die molekularen Ereignisse, die zur Aktivierung der Lipasen durch ihre spezifischen Foldasen führen, nicht verstanden. Es existieren aufgrund der Heterogenität der Faltungszustände von heterolog exprimierter Lipase keine Strukturdaten des Enzyms, bevor es durch sein Chaperon in den katalytisch aktiven Zustand überführt wurde. Durch eine Mutagenesebank von lipH konnten durch ein Oberflächendisplaysystem und anschließendes FACS solche Varianten isoliert werden, die fähig sind, die Lipase zu binden, jedoch nicht mehr zu aktivieren. Durch in vitro Interaktionsexperimente dieser Varianten und der Lipase konnte dieser Befund bestätigt werden, so dass durch Nutzung der Varianten in einer Affinitätsreinigung der Lipase die Möglichkeit gegeben ist, nur solche Konformationszustände einer heterolog exprimierten Lipase in Homogenität zu reinigen, die von den Varianten des Chaperons erkannt werden. Dadurch ist es potentiell möglich, den Faltungszustand der Lipase vor Aktivierung durch die Foldase aufzuklären, wodurch wichtige Informationen bezüglich des molekularen Mechanismus der Aktivierung der Lipase durch ihr Chaperon gewonnen werden könnten. Due to their stability in organic solvents and the independency of essential cofactors, microbial lipases are extensively used in biotechnological applications and organic chemistry. Because of the diverse reactions they catalyze, they are utilized as substitute for detergents in washing agents and for the production of polyunsaturated fatty acids, biopolymers, biodiesel and enantiomerically pure building blocks for pharmaceuticals. For industrial applications, the reactions have to be performed under well-defined conditions. As a result, extensive efforts were conducted to adapt the desired biocatalysts concerning stability, activity and enantioselectivity. Directed evolution has emerged as an efficient method to carry out this tailoring of the enzymes. Homologous expression of secreted enzymatically active microbial lipases is a highly complex process involving various accessory proteins, thus restricting sequence space to carry out directed evolution. On the other hand, heterologous expression is hampered due to the complexity mentioned above. As a consequence, lipases tend to aggregate and form inactive inclusion bodies. Therefore, subsequent in vitro renaturation of the lipase by the aid of its lipase-specific foldase is inevitable. On this account, the efficiency of heterologous expression and consecutive purification of active P. aeruginosa lipase had to be increased. By construction of an N-terminal truncated lipase variant lacking the signal peptide for the translocation across the inner membrane and optimization of the used media, the yield and purity of heterologously produced lipase was significantly enhanced. By making use of this expression system, the second lipase LipC identified in P. aeruginosa was obtained in sufficient yield for the first time, allowing a characterization of the enzyme and making it accessible for biotechnological applications. The long-proposed interaction of the lipase-specific foldase LipH with LipC was proved in in vitro assays, characterizing LipH being the first Lif protein with more than one lipase as a substrate. Despite the similarity of both enzymes in in vitro renaturation like Ca2+- and glycerol dependency and the high homology of LipA and LipC, LipC revealed to possess a larger cavity leading to the active site and showed relaxed substrate specificity. Despite extensive research, the signal mediating type-II dependent protein secretion across the outer membrane has not yet been identified. It was shown that LipC, although being highly homologous to LipA, is not secreted by the “classical” Xcp-apparatus. Comparative structural analyses of the two lipases and other type II secreted proteins revealed surface patches that are significantly different in LipA and LipC. A mutagenesis of this putative secretion signal in LipA influenced indeed secretion of the enzyme. This suggests that these patches, which are shared also by LasB and ToxA, mediate the recognition between the exoproteins and the Xcp type II machinery. The lipase variant LipA 1H8 was derived from a directed evolution approach that showed increased enantiopreference of E=51 compared to E=1.1 against the (S)-enantiomer of the substrate 2-MDA-pNP. However, this variant could not be produced with satisfying yield in the homologous host. As reason, a secretion defect for this lipase could be observed. Comparative analysis of the secretion of LipA 1H8 and variants carrying the respective single mutations revealed that just two of the six mutations are responsible for the impairment in secretion, which are not involved in the enhanced enantioselectivity. The high affinity that lipases exhibit towards their cognate foldases was successfully utilized for establishing a novel purification strategy of heterologously expressed lipase. This approach combines the advantages of one-step affinity purification with simultaneous in vitro activation and immobilization of the biocatalyst. The strategy enables to perform a purification independent of the biochemical properties of the lipase to obtain. Although the lipase remains bound to its chaperone in a stable complex, it shows the same catalytic properties compared with active lipase produced in the homologous host. With this approach, it was also possible for the first time to purify lipase 1H8 in high amounts and homogeneity, circumventing the secretion defect in the homologous host. Moreover, this lipase variant exhibited the same enantioselectivity like free LipA 1H8 from P. aeruginosa supernatant. Due to the large interface the lipase and the foldase share and the high affinity of the interaction, no possibility of inducing the dissociation of the LipAH complex could be determined. Lif-proteins show strong analogies compared with propeptides of proteases that act as intramolecular chaperones. In performed in silico analyses, all bicistronic operons coding for a lipase and a foldase could be translationally fused by a single point mutation. Such a fusion was constructed for the lipAH operon of P. aeruginosa, resulting in lipolytic activity in the supernatant after homologous expression. However, the enzymatic activity observed relied on specifically proteolytically processed fusion protein, with the arisen LipA- and LipH fragments localized correctly as in the wild type case. Because of the fact that this processing was not observed in E. coli, a specific mechanism for that task seems to exist in P. aeruginosa, suggesting that it is possible that lipA and lipH were former one gene, being subsequently separated in evolution. Up to now, the molecular backgrounds that lead to the activation of lipases by their cognate specific foldases are not completely understood. Due to the heterogeneity of the conformational states of heterologous expressed inactive lipase, no structural data of lipases are available that describe their folding state before the Lif-based activation. Therefore, a library of cell-surface displayed lipH mutants was screened by FACS in order to identify variants that bind LipA but are not capable of activating it. Interaction assays of the identified foldase variants with LipA confirmed this finding. These Lif-proteins could prove useful for obtaining a homogenous preparation of heterologously produced inactive lipase by affinity purification, possibly allowing to solve the structure of inactive bound lipase before the chaperone binds and folds the lipase. This structure could reveal important information concerning the molecular mechanism of the activation of the lipases by their specific foldases.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Enzymtechnologie
Dokument erstellt am:	01.07.2008
Dateien geändert am:	01.07.2008
Promotionsantrag am:	15.04.2008
Datum der Promotion:	03.06.2008