Dokument: Funktionelle Charakterisierung neuer Isoformen des Tumorsuppressors p53

Titel:	Funktionelle Charakterisierung neuer Isoformen des Tumorsuppressors p53
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=8297
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20080702-121637-0
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Dr. Graupner, Vilma [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 8,76 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 30.06.2008 / geändert 01.07.2008
Beitragende:	Prof. Dr. Schulze-Osthoff, Klaus [Gutachter] Prof. Dr. Wunderlich, Frank [Gutachter]
Stichwörter:	Apoptose, p53, p53-Isoformen
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	2005 beschrieben Bourdon et al. die Expression von insgesamt neun humanen p53-Isoformen. Die Proteine p53β, Δ40p53β und Δ133p53β wurden durch die Verwendung eines gegen den spezifischen C-Terminus der Proteine gerichteten Antikörpers nachgewiesen (Bourdon et al. 2005; Murray-Zmijewski et al. 2006). Zudem beschrieben die Autoren, dass p53β DNA bindet, mit wtp53 (p53α) interagiert und die wtp53-regulierte Transkription ausgehend von einem bax-Promotorkonstrukt unter Stressbedingungen positiv reguliert. Für die N-terminal verkürzten Isoformen Δ40p53 und Δ133p53 ist ein dominant-negativer Effekt gegenüber wtp53 bekannt (Courtois et al. 2002; Ghosh et al. 2004; Murray-Zmijewski et al. 2006). Da im Gegensatz zu den zahlreichen Studien über den Einfluss posttranslationaler Modifikationen auf die Aktivität von wtp53 sehr wenig über die Funktion der p53-Isoformen bekannt ist, war es das Ziel der vorliegenden Arbeit, die beiden p53-Isoformen p53β und p53γ im Vergleich zu wtp53 zu charakterisieren. Dazu wurden klonale RKO-Zelllinien generiert, welche die Flag-markierten Transgene wtp53, p53β und p53γ gemeinsam mit endogenem wtp53 stabil exprimieren. Mit Hilfe dieser Klone wurde der Einfluss von p53β und p53γ auf wtp53-regulierte Signalwege wie Apoptose, Zellzyklusarrest und Seneszenz untersucht. Die vorliegende Arbeit zeigt, dass die Isoformen p53β und p53γ durch den Verlust der Tetramerisierungs- und basischen Domäne nicht mit wtp53 interagieren und ebenso die Fähigkeit verloren haben, DNA zu binden. Aufgrund dieser Fehlfunktion können sie nicht wie wtp53 als Transkriptionsfaktor fungieren und auch die Aktivität von wtp53 nicht direkt beeinflussen. Im Gegensatz zu wtp53 konnten p53β und p53γ auch nicht an den Mitochondrien nachgewiesen werden, was ihre Beteiligung an einem p53-vermittelten Transkriptions-unabhängigen Signalweg ausschließt. Allerdings könnten p53β und p53γ einen indirekten Einfluss auf wtp53 durch die Konkurrenz um die Bindung von Kofaktoren ausüben. Ebenso kann ihre Expression auf mRNA-Ebene zu einer Verringerung der wtp53-Expression und damit zu einer Reduktion der wtp53-Aktivität führen. Neben der Untersuchung der Funktion einiger der 2005 beschriebenen p53-Isoformen war es ein weiteres Ziel dieser Arbeit, Zielgene von p53 innerhalb der Bcl-2-Proteinfamilie zu identifizieren. Abgesehen von den BH3-only Proteinen Noxa, Puma und Bid war bax bereits 1995 als Zielgen von p53 im Menschen beschrieben worden (Miyashita und Reed 1995). Die Promotorsequenz des homologen Multidomänenproteins Bak wurde daher auf potentielle p53-Bindungsstellen untersucht. Tatsächlich konnten bei der Promotoranalyse des bak1-Genlokus drei potentielle p53-Bindungsstellen identifiziert werden. Eine Reportergenanalyse verifizierte die p53-abhängige Transaktivierung des bak-Promotorkonstrukts und identifizierte zugleich die für die Aktivierung der Transkription entscheidende p53-Bindungsstelle, an welche eine Bindung von p53 nachgewiesen werden konnte. In 2005 Bourdon et al. revealed that nine isoforms can be expressed from the human p53 gene locus. The proteins p53β, Δ40p53β and Δ133p53β were detected in several human carcinoma cell lines by using an antibody directed against the specific C-terminus of these proteins (Bourdon et al. 2005; Murray-Zmijewski et al. 2006). The authors further described binding of p53β to DNA, an interaction of p53β with wtp53 (p53α) and the positive regulation of stress-induced wtp53-mediated transactivation of a bax promotor construct by p53β. The N-terminally truncated isoforms Δ40p53 and Δ133p53 exhibit a dominant-negative effect towards wtp53 (Courtois et al. 2002; Ghosh et al. 2004; Murray-Zmijewski et al. 2006). In contrast to an overwhelming knowledge concerning the influence of multiple posttranslational modifications on the activity and function of the tumour suppressor protein p53, there is clearly a paucity of information on the role of alternatively spliced p53 isoforms in these processes. Therefore, the present study aimed to characterize the two isoforms p53β and p53γ in comparison to wtp53. To this end RKO cell lines were generated stably expressing Flag-tagged versions of wtp53, p53β and p53γ together with the endogenous wtp53 protein. By the use of these cell lines the influence of p53β and p53γ on wtp53-regulated signalling pathways like apoptosis, cell cycle arrest and senescence was analyzed. The presented data reveal that due to their loss of the tetramerization and basic domain p53β and p53γ are virtually unable to interact with wtp53 or bind to DNA. Consequently and in contrast to wtp53, they cannot act as a transcription factor or directly influence the activity of wtp53. As, unlike wtp53, both C-terminally truncated p53 isoforms do also not translocate to mitochondria upon stress induction, these data provide strong evidence that p53β and p53γ do neither modulate transcription-dependent nor –independent events mediated by wtp53. Nevertheless, it is still possible that p53β and p53γ indirectly influence the function of the wtp53 protein by competing for the binding of cofactors. Similarly, their expression on the mRNA level may lead to a reduced wtp53 expression and thereby to a decrease in wtp53 activity. In addition to the analysis of p53 isoforms, another aim of this work was the identification of novel p53 target genes within the Bcl-2 protein family. Besides the BH3-only proteins Noxa, Puma and Bid bax was described to be a target gene of p53 in humans (Miyashita und Reed 1995). Therefore the promotor sequence of the homologous protein Bak was analyzed and indeed, three potential p53 binding sites could be identified. The p53-dependent transactivation of a bak promotor construct and the p53 binding site responsible for it were verified by reporter gene studies. Furthermore, binding of p53 to the p53 binding site critical for transactivation could be demonstrated.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Medizinische Fakultät » Institute » Institut für Molekulare Medizin
Dokument erstellt am:	01.07.2008
Dateien geändert am:	01.07.2008
Promotionsantrag am:	28.04.2008
Datum der Promotion:	16.06.2008