Dokument: Molekulare Analyse der Chemotherapeutika-induzierten Apoptose und der Therapieresistenz
| Titel: | Molekulare Analyse der Chemotherapeutika-induzierten Apoptose und der Therapieresistenz | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=8217 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20080714-114031-8 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Deutsch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Dr. rer. nat. Janssen, Katja [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof.Dr. Heinz Mehlhorn [Gutachter] Prof. Dr. Schulze-Osthoff, Klaus [Gutachter] | |||||||
| Stichwörter: | Apoptose, Taxol, Thapsigargin, ER, Chemotherapeutika | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie | |||||||
| Beschreibungen: | Die Wirksamkeit klassischer Chemotherapeutika, die in Zellen Apoptose auslösen, ist in hohem Maße abhängig von der Integrität der jeweiligen induzierten apoptotischen Signaltransduktionswege. Die Inaktivierung von Apoptose-induzierenden Signalwegen stellt jedoch einen entscheidenden Selektionsvorteil für maligne Tumore während der Genese dar. Daher sind Defekte wesentlicher Komponenten dieser Signaltransduktionswege ein häufiger Befund in humanen Tumoren und können zur Resistenz dieser Tumore gegen eine konventionelle Chemotherapie führen. Eine genaue Kenntnis der ablaufenden, molekularen Prozesse könnte zur Entwicklung spezifischer Strategien zur Umgehung von Tumorresistenzen genutzt werden. In der vorgelegten Arbeit wurden daher die zellulären Signaltransduktionsprozesse unter Behandlung mit Taxol und Thapsigargin untersucht.
1. Mechanismus des Taxol-induzierten Zelltodes Taxol gehört zu den Mikrotubuli-interferierenden Chemotherapeutika und induziert Apoptose in Tumorzellen. Das Chemotherapeutikum wird daher seit längerer Zeit in der Behandlung von Ovarialkarzinomen, fortgeschrittenen Mammakarzinomen und fortgeschrittenen, nicht-kleinzelligen Lungenkarzinomen (non small cell lung cancer, NSCLC) eingesetzt. Häufig wird eine Resistenz von Tumoren gegenüber Chemotherapeutika durch eine Fehlregulation apoptotischer Signalwege und der beteiligten Modulatoren bedingt. Deshalb war es Ziel dieser Arbeit, den Mechanismus der Taxol-induzierten Apoptose aufzuklären und zentrale Komponenten zu identifizieren. Dazu wurden Modellsysteme verwendet, in denen apoptotische Schlüsselproteine auf Grund spezifischer Gen-Deletionen nicht mehr exprimiert werden. Früherer Studien liessen vermuten, dass Taxol-induzierte Apoptose Caspase-10-abhängig sei. Im Rahmen dieser Arbeit konnte jedoch mit Hilfe verschiedener zellulärer Modellsysteme, in denen Caspase-10 nicht exprimiert wird, eindeutig nachgewiesen werden, dass Taxol Apoptose unabhängig von Caspase-10 induziert. Mit Hilfe durchflusszytometrischer Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass Zellen, trotz fehlender Caspase-10-Expression, nach Taxol-Behandlung charakteristische Apoptose- Merkmale wie z.B. DNA-Fragmentierung, die Exposition von Phosphatidylserin und den Verlust des mitochondrialen Transmembranpotentials aufwiesen. Auch Caspase-10-defiziente MCF-7 Mammakarzinomzellen wurden durch Taxol-Behandlung effizient eliminiert. Eine Rekonstitution dieser Zellen mit Caspase-10 erhöhte die Sensitivität für Taxol nicht weiter. Für die Aktivierung von Caspase-10 und ihrem funktionellen Homolog, der Caspase-8, ist das Adapterprotein FADD erforderlich. FADD- und Caspase-8-defiziente Jurkat-T-Lymphozyten waren jedoch ebenso sensitiv für Taxol wie Wildtyp (WT) Zellen. Auch wiesen diese Zellen nach Taxol-Behandlung apoptotische Charakteristika auf. Mittels Western Blot-Analysen konnte eine Aktivierung von Caspase-3 nachgeweisen werden, die kennzeichnend für die Effektorphase der Apoptose ist. Dies ist ein weiterer Hinweis dafür, dass der extrinsische Apoptosesignalweg und seine zentralen Modulatoren, Caspase-10 bzw. -8 und FADD, keinen Einfluss auf die Induktion von Zelltod nach Taxol-Behandlung haben. Die hier durchgeführten Untersuchungen ergaben hingegen, dass Taxol-vermittelte Apoptose über den intrinsischen Signalweg verläuft. Caspase-9 konnte als zentraler Regulator Taxol-induzierter Apoptose identifiziert werden. Zelluläre Modelle, denen die Caspase-9-Expression fehlte, waren resistent gegen Taxol. In durchflusszytometrischen Untersuchungen wiesen diese Zellen nach Behandlung mit dem Chemotherapeutikum weder DNA-Fragmentierung noch einen Verlust des mitochondrialen Transmembranpotentials oder Phosphatidylserin-Exposition auf. Auch die Aktivierung der Effektorcaspase-3 konnte in Zellen ohne Caspase-9-Expression nicht detektiert werden. Caspase-9 wird nach Induktion des intrinsischen Signalweges im Apoptosom aktiviert. Eine der zentralen Komponenten des Apoptosoms ist Apaf-1. Auch Apaf-1-defiziente Zellen waren in den im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Untersuchungen resistent gegenüber Taxol. Dies bestätigt die zentrale Rolle der Caspase-9 im Taxol-vermittelten Signaltransduktionsweg. Obwohl fluoreszenz-mikroskopische Untersuchungen zeigten, dass nach Taxol-Behandlung auch in Apaf-1- und Caspase-9-defizienten Zellen die charakteristische Bildung multipolarer Spindeln zu beobachten war, konnte Zelltod, in Abwesenheit der beiden zentralen Apoptosemodulatoren, nicht induziert werden. Klonogenitäts-Tests zeigten außerdem, dass Apaf-1-/--und Caspase-9-/--MEFs eine Behandlung mit Taxol nicht nur überlebten, sondern sogar die Proliferation wieder aufnehmen konnten. Dies zeigt, dass eine Inaktivierung von Caspasen ausreichend ist, um Tumoren einen Überlebensvorteil unter Chemotherapie mit Taxol zu verleihen. Die entscheidende Bedeutung des intrinsischen Apoptosesignalweges für Taxol-vermittelte Apoptose konnte hier auf Grund einer Regulation des induzierten Zelltodes durch Proteine der Bcl-2-Familie bestätigt werden. Die Familie der Bcl-2-Proteine teilt sich in pro- und antiapoptotische Mitglieder, die die Freisetzung apoptogener Substanzen wie z.B. Cytochrom c aus dem Intermembranraum der Mitochondrien, regulieren. Bisher nahm man an, dass die proapoptotischen Bcl-2-Proteine Bak und Bax hierbei redundante Funktionen übernehmen. Während Taxol-induzierter Apoptose zeigte sich jedoch, dass Zellen ohne Bak-Expression sehr sensitiv auf eine Taxol-Behandlung reagierten, während Bax-defiziente Zellen partiell protektiert waren. Dies konnte in durchflusszytometrischen Untersuchungen des induzierten Zelltodes, der DNA-Fragmentierung sowie der Reduktion des mitochondrialen Transmembranpotentials, insbesondere nach Behandlung mit niedrigen Taxol-Konzentrationen, nachgewiesen werden. Im Gegensatz zu Bak-defizienten oder WT Zellen konnten Bax-defiziente Zellen nach kurzzeitiger Taxolbehandlung außerdem die Proliferation wieder aufnehmen. Dies macht deutlich, dass Taxol Apoptose über einen Bax-kontrollierten Signalweg induziert, der durch Bak nicht vollständig kompensiert werden kann. Bak und Bax werden durch BH3-only Proteine der Bcl-2-Familie aktiviert. Dazu gehört Bim, das unter physiologischen Bedingungen mit den Mikrotubuli assoziiert ist und erst nach Apoptoseinduktion aus dieser Bindung freigesetzt wird. In der vorgelegten Arbeit konnte gezeigt werden, dass auch eine fehlende Expression von Bim Zellen partiell vor Taxol-induzierter Apoptose protektiert. Bim und Bax sind daher wichtige Komponenten des Signaltransduktionsweges, der nach Taxol-Behandlung zur Induktion von Zelltod führt. 2. ER-Stress-induzierte Apoptose ist abhängig von Caspase-9 und ihrer Aktivierung im Apoptosom In eukaryontischen Zellen ist das endoplasmatische Retikulum (ER) der Ort an dem Transmembran- und sezernierte Proteine synthetisiert, in ihre native Konformation gefaltet, posttranslational modifiziert und schließlich zu ihrem endgültigem Bestimmungsort transportiert werden. Daher muss im ER ein Millieu aufrechterhalten werden, dass diese Prozesse optimal unterstützt. Wird dieses Millieu entscheidend verändert, z.B. wenn Calcium-Konzentrationen sich ändern, posttranslationale Modifikationsmechanismen gestört sind oder neu gebildete Proteine schneller in das ER-Lumen eindringen als sie prozessiert werden, so erzeugt dies eine Stresssituation für das ER. ER-Stress führt zur Induktion koordinierter Signaltransduktionswege, die unter dem Begriff „unfolded protein response“ (UPR) zusammengefasst werden. Bei milden Stresssituationen dient die UPR der Wiederherstellung physiologischer Bedingungen im ER. Nach gravierender Störung der ER-Physiologie kann die UPR allerdings auch Apoptose durch noch nicht genau charakterisierte Signaltransduktionswege initiieren. Frühen Studien zu Folge sollte eine am ER lokalisierte Caspase, Caspase-12, eine für ER-Stress spezifische Signalkaskade aktivieren. Dies konnte jedoch in neueren Studien nicht reproduziert werden. Es konnte hingegen gezeigt werden, dass murine Zellen ohne Caspase-12-Expression nicht gegen ER-Stress protektiert waren. Biochemische Studien demonstrierten außerdem, dass Caspase-12 eine auf Autoproteolyse beschränkte Aktivität aufweist und keine anderen Caspasen prozessiert. Im humanen System ist Caspase-12 funktionell inaktiv. Es ist deshalb unwahrscheinlich, dass Caspase-12 eine wesentliche Rolle im ER-Stress-induziertem Zelltod spielt. Der tatsächlich verantwortliche Signaltransduktionsweg war daher noch unklar. Um den Mechanismus ER-Stress-induzierter Apoptose zu klären, wurden Zellmodelle eingesetzt, denen die Expression wichtiger Apoptoseregulatoren fehlt. In der vorgelegten Arbeit konnte gezeigt werden, dass ER-Stress-induzierte Apoptose nicht, wie bisher angenommen, über eine ER-spezifische Caspase-Kaskade, sondern über den intrinsischen, mitochondrialen Signalweg vermittelt wird. Durch Experimente in zellulären Modellsystemen ohne Caspase-9-Expression wurde deutlich, dass diese Caspase der zentrale Initiator von Apoptose nach ER-Stress ist. Nach Behandlung mit ER-Stress-induzierenden Reagenzien wiesen sowohl humane als auch murine Caspase-9-defiziente Zellen in durchflusszytometrischen Untersuchungen keinerlei Apoptose-typische Veränderungen wie z.B. DNA-Fragmentierung, die Exposition von Phosphatidylserin oder den Zusammenbruch des mitochondrialen Transmembranpotentials auf. Dies traf auch auf Zellen zu, die auf Grund einer fehlenden Apaf-1-Expression kein Apoptosom ausbilden können. Daraus lässt sich folgern, dass Caspase-9 nach ER-Stress durch das Apoptosom und nicht durch eine ER-Stress-spezifische Caspase-Kaskade aktiviert wird. Biochemische Analysen der Caspase-Aktivität sowie Immunpräzipitationen aktivierter Caspasen demonstrierten außerdem, dass in Caspase-9- und Apaf-1-defizienten Zellen keine weitere Caspase-Aktivierung nach Behandlung mit ER-Stress-induzierenden Reagenzien nachweisbar ist. Frühere Untersuchungen liessen vermuten, dass auch Caspase-2 eine Rolle bei der Induktion von Zelltod nach ER-Stress spielt. Durch Untersuchungen von Caspase-2-defizienten Zellen konnte im Rahmen dieser Arbeit gezeigt werden, dass fehlende Caspase-2-Expression nicht vollständig gegen ER-Stress protektiert. Das Einsetzen des Zelltodes war jedoch im Vergleich zu WT Zellen deutlich verzögert. Es wurde vermutet, dass Caspase-2 nach ER-Stress Apoptose durch die aktivierende Spaltung des Substrates Bid, ein BH3-only Protein der Bcl-2-Familie, initiiert. Bid kann die proapoptotischen Proteine Bax und Bak vermutlich direkt aktivieren und so die Cytochrom c-Freisetzung aus den Mitochondrien verursachen. In Caspase-2-/--Zellen ist die Cytochrom c-Freisetzung nach ER-Stress jedoch nicht beeinträchtigt. Außerdem konnte hier gezeigt werden, dass Zellen, die kein Bid exprimieren, nicht gegen ER-Stress geschützt sind. Das Auftreten charakteristischer, biochemischer Merkmale der Apoptose ist in Caspase-2-/--Zellen verzögert. Enzymatische Tests demonstrierten, dass die Effektorcaspase-3 in Caspase-2-defizienten Zellen erst spät aktiviert wird. Auch DNA-Fragmentierung konnte in Caspase-2-/--MEFs erst nach viertägiger Behandlung nachgewiesen werden, während dies in WT Zellen bereits nach zwei Tagen zu detektieren war. Diese Ergebnisse deuten an, dass Caspase-2 an einer Amplifizierungsschleife der Caspase-9-vermittelten Apoptose beteiligt ist. 3 Bei fehlender Expression der Bcl-2-Proteine Bak und Bax führt Thapsigargin-Behandlung zu nekrotischem Zelltod Gravierender ER-Stress, der nicht mehr behoben werden kann, führt, vergleichbar mit den meisten klassischen Chemotherapeutika, zur Induktion von Apoptose über den intrinsischen, mitochondrialen Signalweg. Die Transduktion des Signals über diesen Weg wird durch Mitglieder der Bcl-2-Familie reguliert, die sich aus pro- und antiapoptotischen Proteinen zusammensetzt. Sowohl eine Überexpression antiapoptotischer Proteine dieser Familie, wie z.B. Bcl-2, als auch eine reduzierte Expression proapoptotischer Faktoren, wie z.B. Bax und Bak, kann ursächlich an der Entstehung von Resistenzen von Tumoren gegen chemotherapeutische Behandlung beteiligt sein. Ziel dieser Arbeit war es daher zu überprüfen, ob diese Proteinfamilie auch bei der Apoptoseinduktion durch ER-Stress-induzierende Reagenzien eine wichtige Rolle spielt. Es wurde bereits gezeigt, dass eine fehlende Expression von Bak und Bax Zellen vor der Induktion von Apoptose nach Behandlung mit Tunicamycin, einem Inhibitor der posttranslationalen Proteinglykosylierung, protektiert. Dies führte zu der Annahme, dass Bak/Bax-/--Zellen, die gegen die meisten Chemotherapeutika resistent sind, auch allgemein gegen ER-Stress-induzierende Agenzien protektiert sind. In der hier vorgelegten Arbeit konnte jedoch gezeigt werden, dass Bak/Bax-/--Zellen bei Behandlung mit Thapsigargin, einem spezifischen Inhibitor der ER SERCA-ATPasen, effizient eliminiert werden können. Die Aktivität der SERCA-ATPasen ist für die Aufrechterhaltung der ER-Ca2+-Homöostase von wesentlicher Bedeutung. Die Thapsigargin-vermittelte Inhibition der SERCA-Pumpen bedingt den Ausstrom von Ca2+ aus dem ER-Lumen ins Zytoplasma. Durch Aufnahme von Ca2+ in die Mitochondrien wird dem lokalen Anstieg der zytoplasmatischen Ca2+-Konzentration entgegen gewirkt. Auf Grund der Aktivität des in der Mitochondrienmembran lokalisiertem Na+/Ca2+-Ionenaustauschers akkumulieren hohe Ca2+-Konzentration in der mitochondriale Matrix, wodurch es zur Öffnung der MPT (mitochondrial permeability transition)-Pore in der inneren Mitochondrienmembran kommt. Durch diese Öffnung gelangen lösliche Substanzen ( 1,5 kDa) und Wasser in die Matrix. Sowohl in WT als auch in Bak/Bax-/--MEFs führt dies zunächst zum Anschwellen der mitochondrialen Matrix und später zum Zusammenbruch des mitochondrialen Transmembranpotentials (∆Ψm). In WT Zellen kann ein Zerreißen der äußeren Mitochondrienmembran auf Grund zu starker Anschwellung und Ausdehnung der Matrix wahrscheinlich durch die Oligomerisierung von Bak und Bax und der dabei in der äußeren Mitochondrienmembran entstehenden Poren verhindert werden. Durch sie kann sowohl Ca2+ als auch Wasser zurück ins Zytoplasma fließen. Dadurch bleiben die Mitochondrien intakt und Apoptose wird durch Aktivierung des intrinsischen Signalweges induziert. Bak/Bax-/--Zellen gehen dagegen nekrotisch zugrunde, weil die vollständige Zerstörung der Mitochondrien eine regulierte Form des Zelltodes nicht mehr zulässt. Durchflusszytometrische Untersuchungen zeigten, dass die erhöhte zytoplasmatischen Ca2+-Konzentrationen in Bak/Bax-/--MEFs tatsächlich für die Induktion von Zelltod nach Thapsigargin-Behandlung verantwortlich ist. Zellen, die mit Thapsigargin und dem zellpermeablen Ca2+-Chelator BAPTA-AM behandelt wurden, zeigten eine erhöhte Überlebensrate. Der Thapsigargin-induzierte Zelltod konnte nur in WT Zellen nicht jedoch in Bak/Bax-defizienten Zellen durch den Caspase-Inhibitor Q-VD-OPh inhibiert werden. In Bak/Bax-/--MEFs induziert Thapsigargin daher einen Caspase-unabhängigen Zelltod. Eine morphologische Analyse dieser Zellen mittels Elektronenmikroskopie zeigte Anzeichen von akutem ER-Stress, wie z.B. einem erweitertem ER und dem Auftreten von Autophagosomen. Außerdem traten charakteristische Merkmale des nekrotischen Zelltodes, u.a. stark angeschwollene Mitochondrien und eine teilweise zerstörte Plasmamembran. Bak/Bax-/--Zellen gehen nekrotisch zugrunde, weil die Zerstörung der Mitochondrien eine regulierte Form des Zelltodes nicht mehr zulässt. Ursache dieser nekrotischen Veränderungen kann, neben dem mechanischem Zerreißen der äußeren Mitochondrienmembran durch den Einstrom von Wasser in die Mitochondrienmatrix, auch eine Ca2+-vermittelte Aktivierung von Hydrolasen, wie z.B. Phospholipase A2 (PLA2) oder C (PLC) sein. Diese Enzyme schädigen sowohl Plasma- als auch Mitochondrienmembranen. Obwohl sowohl Thapsigargin als auch Tunicamycin ER-Stress induzieren, unterscheiden sich folglich beide Substanzen deutlich in ihrer Abhängigkeit von Bak und Bax bei der Induktion des Zelltodes.1. Mechanisms of taxol-induced cell death Taxane derivatives such as taxol elicit their antitumor effects, at least in part, by induction of apoptosis, but the underlying mechanisms are incompletely understood. In this thesis, different cellular models with deficiencies in key regulators of apoptosis were employed to elucidate the molecular mechanism of taxol-induced cell death. Apoptosis by taxol was previously reported to depend on the activation of the initiator caspase-10 in the death receptor-mediated extrinsic pathway. In this study, however, it could be demonstrated that taxol kills murine embryonic fibroblasts (MEFs) devoid of caspase-10 expression. Furthermore, human tumor cell lines deficient in caspase-10 or its functional homolog, caspase-8, were similarly sensitive towards taxol than wildtype cells. Even cells lacking the adapter protein FADD, that is crucial for the activation of both caspase-10 and -8, could be efficiently eliminated by taxol. Hence, taxol-induced cell death is clearly independent of the death receptor pathway. In contrast, the lack of apaf-1 or caspase-9, key components of the apoptosome and regulators of the mitochondrial pathway, not only entirely protected against taxol-induced apoptosis, but could even confer clonogenic survival, depending on the cell type and drug concentration. Thus, taxol triggers apoptosis not through caspase-10, but via caspase-9 activation at the apoptosome. This conclusion was further supported by the fact that taxol-induced apoptosis was regulated by Bcl-2 proteins, a family of pro- and antiapoptotic proteins controlling the release of apoptogenic factors, like cytochrome c, from the mitochondria in the intrinsic apoptotic pathway. Cells overexpressing antiapoptotic Bcl-2 or cells doubly deficient in the proapoptotic proteins Bak and Bax were entirely resistant to taxol-induced apoptosis. Interestingly, also the single knockout of Bax, but not that of Bak, conferred partial resistance, suggesting a particular role of Bax that has previously been assumed to be only a functionally redundant homolog of Bak. Furthermore, loss of the proapoptotic BH3-only Bcl-2 protein Bim partially protected cells from taxol-induced death. The proapoptotic Bim protein is normally sequestered by binding to microtubules. Upon stabilization of microtubules by taxol this binding is lost. Released Bim can then probably directly activate Bax and Bak to mediate apoptosis. In conclusion, these findings suggest a particular role of the Bcl-2 proteins Bim and Bax as mediators in the cell death pathway activated by taxol. 2. ER stress-induced apoptosis depends on caspase-9 and its activation by the apoptosome In eukaryotic cells the endoplasmic reticulum (ER) is the site where secretory and transmembrane proteins are synthesized, folded into their native conformation, posttranslationally modified and delivered to their final destination. Therefore, the ER has to provide and maintain an optimal environment for protein folding and disulfide bond formation. The physiological state of the ER lumen can be perturbed, for instance, when the influx of nascent proteins exceeds the processing capacity, when posttranslational protein modification fails or when calcium concentrations are altered. ER stress like this activates coordinated signal transduction pathways collectively termed the unfolded protein response (UPR). The UPR restores ER homeostasis after mild insults. However, in response to severe stress the UPR can also trigger apoptosis. The molecular mechanism underlying ER stress-induced apoptosis, however, is still largely unknown. Early studies suggested an activation of a caspase cascade by the ER localized caspase-12. More recent studies, however, could not reproduce this finding and demonstrated that murine cells devoid of caspase-12 expression were not resistant against ER-induced apoptosis. Caspase-12 of rodent origin was shown to be catalytically restricted to autoproteolysis and could not cleave any other caspase in vitro. Due to a single nucleotide polymorphism (SNP) humans express either a truncated version consisting only of the catalytically inactive prodomain of caspase-12 or, more rarely, a full length protein that seems to be also proteolytically inactive and does not sensitize to ER stress. A role of caspase-12 as in initiator caspase starting a caspase cascade in response to ER stress, therefore, seems to be unlikely. Thus, to elucidate the mechanism of ER stress-induced cell death, cellular models lacking the expression of key apoptosis regulators were employed in this study. Murine embryonic fibroblasts devoid of caspase-9 expression, the key initiator caspase activated in the apoptosome in response to mitochondrially triggered apoptosis, were completely protected against various ER stress-inducing agents. Thapsigargin, an inhibitor of ER Ca2+ transporters, the SERCA ATPases, as well as tunicamycin, an inhibitor of posttranslational protein glycosylation and brefeldin A, an inhibitor of vesicle transport from the ER to the Golgi complex, all efficiently induced apoptotic cell death in the corresponding wildtype MEFs. The mode of death was confirmed to be apoptosis by flow cytometric detection of characteristical DNA fragmentation, decrease of the mitochondrial membrane potential and by detection of caspase activity employing a fluorescence-based approach using fluorescence-coupled caspase substrates. Consistently, similar results were obtained with apaf-1-/--MEFs, deficient in apoptosome formation. Compared to caspase-9-/--MEFs, cells devoid of apaf-1 expression were equally resistant to ER stress mediated by thapsigargin, brefeldin A or tunicamycin. Deficiency in either caspase-9 or apaf-1 furthermore inhibited the release of cytochrome c from the mitochondria. Interestingly, no residual caspase activity could be measured in cells lacking caspase-9 or apaf-1 expression in response to ER stress, making it highly unlikely, that another caspase cascade could be involved. That these findings were not restricted only to murine cells could be demonstrated employing human Jurkat T cells deficient in caspase-9 expression and a respective reconstituted cell line. Similarly, caspase-9 deficient cells were not sensitive to ER stress-mediated apoptosis, whereas their reconstituted counterparts were efficiently killed. Importantly, by immunoprecipitation of active caspases employing a biotin conjugated substrate, it could be clearly demonstrated that the activation of other caspases was absolutely dependent on caspase-9. Therefore, in response to ER stress caspase-9 acts as the main initiator caspase. Furthermore, in contrast to a previous publication the results show that caspase-9 is not activated by another upstream caspase, but by the formation of the apoptosome. The lack of caspase-9 or apaf-1 even conferred clonogenic survival after exposure to the ER stress-inducing chemotherapeutic thapsigargin. Previously, it has been assumed that caspase-2 might be involved in ER stress-induced apoptosis. However, as demonstrated here, the loss of caspase-2 only delayed death, but did not protect the cells. Furthermore, caspase-2 has been suggested to be involved in the release of cytochrome c from the mitochondria by cleavage-mediated activation of the proapoptotic BH3-only protein Bid. Nevertheless, cytochrome c release was not diminished in caspase-2-/- cells compared to wildtype cells in response to ER stress. The occurrence of other biochemical traits of apoptosis like the decrease of the mitochondrial membrane potential or DNA fragmentation were clearly decelerated, but not prevented. Therefore, caspase-2 is probably involved in an amplification loop accelerating caspase-9-mediated apoptosis in response to ER stress. 3. Loss of the proapoptotic Bcl-2 proteins Bak and Bax alters the ER stress-induced mode of cell death from apoptosis to necrosis Similar to classical chemotherapeutic treatment, severe ER stress that cannot be resolved leads to apoptosis by the intrinsic, mitochondrial pathway. Signal transduction via this pathway is closely regulated by members of the Bcl-2 family of proteins that includes pro- and antiapoptotic members. Overexpression of antiapoptic proteins of this family, like Bcl-2, as well as decreased expression of proapoptotic factors, like Bax and Bak, can be causally involved in the resistance of tumors to conventional chemotherapeutic agents. Likewise, double knockout (DKO) cells from mice deficient in expression of Bak and Bax have been shown to be resistant to ER stress-mediated apoptosis induced by tunicamycin, an inhibitor of N-linked glycosylation. This has led to the generalized assumption that Bak/Bax-/- cells that are protected against a wide variety of stress stimuli activating the mitochondrial apoptotic pathway would be similarly resistant to different ER stress-inducing agents. In this study, however, it could be demonstrated employing murine embryonic fibroblasts (MEFs) derived from Bak/Bax-DKO mice that Bak/Bax-/- cells are, in contrast, efficiently killed by ER stress mediated by thapsigargin, a specific inhibitor of ER SERCA-pumps. Importantly, whereas calcium overload of mitochondria inflicted by thapsigargin treatment led to apoptosis induction in wildtype cells, Bak/Bax-/- cells were killed by a caspase-independent cell death as could be confirmed by flow cytometric analysis of cell death in the presence of the caspase inhibitor Q-VD-OPh. Whereas this inhibitor clearly protected wildtype cells from thapsigargin-induced death, Bak/Bax-/- cells were still efficiently eliminated. The observed decrease in the mitochondrial membrane potential of Bak/Bax-/- cells was similarly not inhibitable by Q-VD-OPh and therefore also caspase-independent. Morphological analysis of these cells employing electron microscopy (EM) revealed signs of acute ER stress, like a dilated ER and the appearance of autophagosomes. Grossly swollen mitochondria, a clumped, but not condensed chromatin, and interruptions of the plasma membrane continuity indicated a necrotic cell death. This was apparently caused by an increase in intracellular Ca2+-levels, due to thapsigargin-mediated inhibition of the SERCA-ATPases because simultaneous treatment of the cells with thapsigargin and the Ca2+-chelator BAPTA-AM decreased the percentage of dead cells. In normal cells a large gradient of Ca2+ exists across the ER membrane, with concentrations reaching millimolar levels in the ER lumen and about 10.000 fold lower concentrations in the cytoplasm (10-100 nm). This gradient is maintained by the SERCA-ATPases that transport Ca2+ into the ER consuming ATP. Thapsigargin is a specific inhibitor of SERCA-pumps and elicits ER stress by a slow depletion of ER Ca2+-levels. The subsequent elevation of cytoplasmic Ca2+-concentrations is buffered by a rapid mitochondrial Ca2+-uptake. If cytoplasmic Ca2+ elevation is lasting, the mitochondrial permeability transition pore (MPT) in the inner mitochondrial membrane is opened. The MPT allows the influx of solutes ( 1,5 kDa) and water and leads to the swelling of the mitochondrial matrix. Under severe stress this pore is permanent and can lead to either apoptotic or necrotic death by a mechanism that is not yet fully clarified. In the present study, thapsigargin induced apoptotic death in wildtype and necrotic death in cells that have no expression of Bak and Bax, indicating a decisive role of these proteins in apoptosis induction upon MPT triggering. Upon activation, Bak and Bax can oligomerize in the outer mitochondrial membrane and mediate the release of apoptogenic factors, like cytochrome c, from the intermembrane space probably by pore formation. This leads to the rapid execution of apoptosis. In Bak/Bax doubly deficient cells the formation of apoptogenic pores is impaired, therefore apoptosis is blocked. The ensuing necrotic death could be due to (1) a rupture of the outer mitochondrial membrane due to excessive swelling of the matrix, and/or (2) an activation of hydrolases like phospholipase A2 (PLA2) or C (PLC), that deconstruct the plasmalemmal as well as the mitochondrial membranes. Measurements of the mitochondrial membrane potential, however, indicated that the loss of ATP production preceded the loss of plasma membrane integrity in Bak/Bax-/- cells. In contrast, Bak/Bax-/- MEFs were completely protected from cell death induced by tunicamycin indicating that these two ER stress-inducing reagents activate different cell death signaling pathways. Concluding, thapsigargin-derived drugs might present powerful alternative tools to eliminate Bak/Bax-deficient tumors that are highly resistent to conventional chemotherapy. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Bezug: | 16.06.2005-16.06.2008 | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Medizinische Fakultät » Institute » Institut für Molekulare Medizin | |||||||
| Dokument erstellt am: | 11.07.2008 | |||||||
| Dateien geändert am: | 11.07.2008 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 21.04.2008 | |||||||
| Datum der Promotion: | 16.06.2008 |
