Dokument: Die Bedeutung von TACC3, eines Proteins der mitotischen Spindel, für die zelluläre Proliferation und Viabilität

Titel:Die Bedeutung von TACC3, eines Proteins der mitotischen Spindel, für die zelluläre Proliferation und Viabilität
Weiterer Titel:Role of the mitotic spindle associated protein TACC3 in cell proliferation and survival
URL für Lesezeichen:https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=8185
URN (NBN):urn:nbn:de:hbz:061-20080703-085121-5
Kollektion:Dissertationen
Sprache:Englisch
Dokumententyp:Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:Text
Autor: Schneider, Leonid [Autor]
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Dateien vom 19.06.2008 / geändert 19.06.2008
Beitragende:Prof. Dr. Dr. Nürnberg, Bernd [Sponsor]
Prof. Dr. Westhoff, Peter [Gutachter]
Stichwörter:TACC3
Dewey Dezimal-Klassifikation:500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:TACC (transforming acidic coiled-coil) Proteine steuern die Zentrosomabhängige Mikrotubuli-Dynamik während der Mitose. Das dritte Mitglied dieser Proteinfamilie, TACC3, wird im hohen Maße während der G2/M-Phase im Zellzyklus exprimiert, wo es an den Zentrosomen und dem mitotischen Spindelapparat lokalisiert. Die essentielle biologische Rolle von TACC3 wurde durch eine konstitutive Geninaktivierung in der Maus deutlich, welche zu einer embryonalen Letalität führte
(Piekorz et al., 2002). Primärzellkulturen aus TACC3-defizienten Embryonen konnten ex vivo nicht expandiert werden und zeigten einen Proliferationsdefekt. Die zugrundeliegenden molekularen Mechanismen, die die zellulären Defekte nach TACC3-Defizienz zur Folge hatten, waren jedoch unklar. Daher wurden im Rahmen dieser Arbeit Zelllinienmodelle etabliert, um die molekularen und zellulären Auswirkungen einer konditionellen, siRNA-vermittelten TACC3-Depletion und somit die Rolle von TACC3 in Proliferation und Zellüberleben zu charakterisieren.
Insbesondere sollten die folgenden Fragen beantwortet werden:
(I) Verursacht TACC3-Depletion Aneuploidie, und wird als Folge ein post-mitotischer
Zellzyklusarrest durch die Aktivierung des G1-Kontrollpunkts ausgelöst?
(II) Was sind die molekularen und zellulären Konsequenzen einer TACC3-Depletion
in Zellen mit einer defekten G1-Kontrollpunkt-Funktion?
(III) Therapeutische Inhibition des mitotischen Spindelapparats mithilfe Mikrotubuliinterferierender
Agenzien wie Paclitaxel ist ein Grundprinzip in der
Tumorbehandlung. Deshalb sollte geklärt werden, ob eine Depletion von TACC3,das oft in erhöhten Mengen in Krebszellen exprimiert wird, zu einer Sensibilisierung gegenüber Paclitaxel-induzierter Wachstumshemmung oder Zelltod führt.
Bezüglich des ersten Punkts konnte gezeigt werden, dass eine Depletion von TACC3 in NIH3T3-Fibroblasten die Interaktion von Spindel-Mikrotubuli mit Chromosomen beeinträchtigte und somit eine Chromosomenfehlanordnung und Aneuploidie
auslöste. Eine deutliche Behinderung der mitotischen Progression trat aber nicht ein. Dagegen war die durch TACC3-Depletion hervorgerufene Aneuploidie postmitotisch mit einer Aktivierung des G1-Kontrollpunkts und Hemmung der weiteren
Zellproliferation assoziert. Diese Antwort war abhängig vom Tumorsuppressor-Protein p53 und seinem transkriptionellen Zielgen und Zellzyklus-Inhibitor p21WAF. Im Gegensatz dazu führte eine Depletion von TACC3 in HeLa-Zellen, die durch
einen defekten G1-Kontrollpunkt und folglich durch ein Fehlen eines G1-Arrests gekennzeichnet sind, zu schwerwiegenden Spindeldefekten und Spindel-
Multipolarität. Die nach TACC3-Depletion deutlich reduzierte mitotische Lokalisation der normalerweise Kinetochor-assozierten Proteine Ndc80, Aurora B und BubR1 spricht für strukturelle Defekte am Kinetochor. Diese Faktoren spielen eine essentielle strukturelle und regulatorische Rolle bei der Steuerung der Mikrotubuli-Kinetochor-Interaktion. Entsprechend arretierten TACC3-depletierte Zellen in der
Mitose aufgrund einer schwerwiegenden chromosomalen Fehlanordnung, was wiederum zum Zelltod durch Caspase-abhängige Apoptose führte. Zellen, die dem mitotischen Arrest und Zelltod durch ein sog. „mitotic slippage“ entgingen, wurden im
hohen Maße polyploid und häuften typischerweise überzählige Zentrosomen an.
Zusammenfassend kann also festgestellt werden, dass ein funktioneller p53/p21WAFKontrollpunkt
in G1 unverzichtbar ist, um einer Genominstabilität entgegenzuwirken, die nach mitotischem Stress durch TACC3-Depletion und unkontrollierter
Weiterproliferation verursacht wird.
Ein TACC3-knock down in NIH3T3-Zellen löste ähnliche molekulare und zelluläre Effekte aus, wie sie für Zellen berichtet wurden, die mit niedrigen, subtoxischen Konzentrationen des chemotherapeutisch eingesetzten Spindelgiftes Paclitaxel (≤10nM) behandelt wurden. Interessanterweise führte eine zusätzliche Paclitaxel-
Behandlung in TACC3-depletierten Zellen, nicht aber in Kontroll-siRNA exprimierenden Zellen, zu einer starken Polyploidisierung mit nachfolgendem Zelltod.
Ebenso wurde die Induktion der zellulären Seneszenz nach TACC3-Depletion in Apoptose-beeinträchtigten MCF7-Zellen durch eine gleichzeitige
Paclitaxelbehandlung stark beschleunigt. Demnach kann TACC3-Depletion Zellen gegenüber der wachstumshemmenden und zelltodauslösenden Wirkung von Paclitaxel sensibilisieren.
Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass TACC3 eine essenzielle Rolle in der Spindeldynamik und bei der korrekten
Chromosomenverteilung und demzufolge in der Aufrechterhaltung der Genomstabilität spielt. Ein TACC3 knock down resultiert in einer Hemmung der
Zellproliferation durch Aktivierung der p53/p21WAF-abhängigen G1-Kontrollpunktantwort. Die hohe Anfälligkeit transformierter und oft G1-Kontrollpunktbeeinträchtigter Zellen gegenüber mitotischem Stress durch TACC3-Depletion identifiziert dieses zentrosomale Protein als ein mögliches therapeutisches Target in der Krebsbehandlung, insbesondere in Verbindung mit chemotherapeutisch eingesetzten Spindelgiften wie Paclitaxel.

TACC (transforming acidic coiled-coil) proteins regulate centrosome-dependent assembly of microtubules during mitosis. The third member of this protein family, TACC3, is highly expressed during the G2/M phase of the cell cycle where it localises
to the centrosome and mitotic spindle apparatus. The critical biological role of TACC3 became evident through constitutive gene inactivation of TACC3 in the mouse which led to an embryonic lethality (Piekorz et al., 2002). Primary cells derived from TACC3
deficient embryos failed to proliferate ex vivo. The underlying molecular mechanisms associated with the effects of TACC3 deficiency were unclear. Therefore, in this thesis cell line models were established to characterise the molecular and cellular
effects of a conditional, siRNA-mediated TACC3 depletion and hence the role of TACC3 in proliferation and cellular survival. In particular, the following questions were addressed:
(I) Does TACC3 depletion cause aneuploidy and as consequence trigger postmitotic cell cycle arrest through the activation of a G1 checkpoint response?
(II) What are the consequences of TACC3 depletion in cells with a compromised G1
checkpoint response?
(III) Therapeutic interference with the mitotic spindle apparatus using microtubuleinterfering agents like paclitaxel is a rationale for the treatment of tumours.
Therefore, does depletion of TACC3, which is often expressed at high levels in cancer cells, sensitize cells to paclitaxel-induced growth inhibition or cell death?
Addressing the first point it is shown that depletion of TACC3 in NIH3T3 fibroblasts affected the attachment of spindle microtubules to chromosomes resulting in
chromosome misalignment and aneuploidy, but without overtly impairing mitotic progression. Postmitotically, aneuploidy through TACC3 depletion was associated withactivation of the G1 checkpoint and inhibition of further proliferation. This response was critically dependent on the tumour suppressor protein p53 and its transcriptional target and cell cycle inhibitor p21WAF. In contrast, in p53-p21WAF-compromized HeLa cells with a defective G1 checkpoint response and hence lack of G1 arrest, the prolonged absence of TACC3 resulted in a severe spindle distortion and multipolarity. Moreover, a progressive deterioration of the structure of the kinetochore, where chromosomes are captured by microtubules, occurred as shown by the delocalisation of the kinetochore-associated proteins
Ndc80, Aurora B and BubR1. These factors play an essential role in the regulation of microtubule-kinetochore interaction. Consequently, due to severely misaligned chromosomes, TACC3 depleted cells arrested in mitosis prior to anaphase and
underwent caspase-dependent apoptosis. Cells that escaped from this arrest by mitotic slippage became highly polyploid and accumulated supernumerary
centrosomes. Thus, a functional p53-p21WAF dependent checkpoint in G1 is indispensable for counteracting genomic instability caused by mitotic stress through TACC3 depletion and further uncontrolled proliferation. Remarkably, TACC3 knock down in NIH3T3 cells elicited similar molecular and
cellular effects as reported for cells treated with low, subtoxic concentrations (≤10nM) of the chemotherapeutically used spindle poison paclitaxel. Interestingly, and unlike in TACC3 expressing cells, paclitaxel co-treatment was able to induce strong
polyploidy and subsequent cell death in TACC3 depleted cells. Consistent with this, the induction of cellular senescence as observed in apoptosis-impaired MCF7 cells upon TACC3 depletion was highly accelerated by paclitaxel co-treatment. Thus,
TACC3 depletion sensitizes to the growth inhibitory and cell death inducing effects of paclitaxel.
In summary, TACC3 plays an essential role in spindle assembly and proper chromosome segregation and hence in maintenance of genomic stability. TACC3
knock down leads to the activation of a growth inhibitory and p53-p21WAF dependent G1 checkpoint response. The high susceptibility of transformed and G1 checkpoint compromised cells to mitotic stress through TACC3 depletion identifies TACC3 as a
possible target for cancer treatment, especially in combination with chemotherapeutic spindle poisons like paclitaxel.
Fachbereich / Einrichtung:Medizinische Fakultät » Institute » Institut für Biochemie und Molekularbiologie II
Dokument erstellt am:19.06.2008
Dateien geändert am:19.06.2008
Promotionsantrag am:24.04.2008
Datum der Promotion:18.06.2008
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