Dokument: Charakterisierung der Hydrogenosomen des anaeroben Pilzes Neocallimastix frontalis -- Proteomanalyse und EST-Sequenzierung
| Titel: | Charakterisierung der Hydrogenosomen des anaeroben Pilzes Neocallimastix frontalis -- Proteomanalyse und EST-Sequenzierung | |||||||
| Weiterer Titel: | Characterization of the hydrogenosomes of the anaerobic fungus Neocallimastix frontalis---Proteomeanalysis and EST sequencing | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=8056 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20080606-092931-5 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Deutsch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Gelius-Dietrich, Gabriel [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof. Dr. Martin, William [Gutachter] Prof. Dr. Lercher, Martin [Gutachter] | |||||||
| Stichwörter: | Neocallimastix frontalis, Hydrogenosomen, Evolution, Proteomanalyse, EST-Datenbank, PFL, OTC | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie | |||||||
| Beschreibungen: | Neocallimastix frontalis, ein anaerober Pilz aus dem Phylum Neocallimastigomycota,
der im Verdauungstrakt der Ruminantia lebt, besitzt als energieliefernde Organellen anstelle von Mitochondrien Hydrogenosomen – eine anaerobe Form der Mitochondrien. Der gemeinsame Ursprung der Hydrogenosomen mit den Mitochondrien sollte anhand neuer charakteristischer Merkmale der Hydrogenosomen von N. frontalis belegt werden. Ferner sollten Unterschiede zu den Hydrogenosomen anderer Organismen gefunden werden, welche die Hypothese einer polyphyletischen Entstehung der Hydrogenosomen verschiedener Gruppen aus Mitochondrien unterstützen. Dazu wurde aus N. frontalis polyadenylierte RNA gereinigt und zur cDNASynthese verwendet. Eine cDNA-Bibliothek wurde erstellt, aus der 1615 zufällig ausgewählte, unabhängige Klone sequenziert und anhand einer BLAST-Suche gegen die nicht-redundante Proteindatenbank des NCBI (National Center for Biotechnology Information) annotiert wurden. Im Laufe der Sequenzierungen wurden Koloniehybridisierungen mit bereits vorhandenen Klonen vorgenommen, um Mehrfachsequenzierungen zu vermeiden. Die Daten wurden in einer MySQL-Datenbank gespeichert und sind mit einer mittels der Skriptsprache PHP erstellten graphischen Benutzeroberfläche über einen Internet-Browser zugänglich. Desweiteren wurden aus N. frontalis Hydrogenosomen mit Hilfe von isopyknischer Zentrifugation isoliert. Die Reinheit der hydrogenosomalen Fraktion wurde durch Messen der Aktivität von Markerenzymen überprüft. Das Proteom der Hydrogenosomen wurde mit Hilfe von zweidimensionaler Gelelektrophorese (1. Trennung nach isoelektrischem Punkt (IEF), 2. Trennung nach Molekulargewicht (SDS-PAGE)) getrennt. Aus diesen Gelen wurden ca. 200 Proteine sequenziert und anhand der erstellten cDNA-Bibliothek identifiziert. Zwei der identifizierten Enzyme wurden genauer untersucht: die Pyruvat-Formiat Lyase (PFL, EC: 2.3.1.54) und die Ornithin Carbamoyltransferase (OTC, EC: 2.1.3.3). Ersteres katalysiert die nicht-oxidative Dissimilation von Pyruvat zu Formiat und Acetyl-CoA und nimmt somit die Stellung des Pyruvat Dehydrogenase Komplexes innerhalb des Kohlenstoffmetabolismus der aeroben Mitochondrien ein. Letzteres ist an der Arginin-Biosynthese beteiligt und bei Eukaryoten üblicherweise in den Mitochondrien lokalisiert. In dieser Arbeit konnte die OTC erstmals auch in den Hydrogenosomen der anaeroben Pilze nachgewiesen werden. In Trichomonas vaginalis – einem mikroaerophilen Humanparasiten, der ebenfalls Hydrogenosomen besitzt – ist die OTC dagegen am vollständig cytosolisch lokalisierten Arginin-Dihydrolase-Weg beteiligt und nicht in den Hydrogenosomen vorhanden. Hiermit sind zwei neue Eigenschaften der Hydrogenosomen von Neocallimastix frontalis gefunden worden, welche die Verwandtschaft der Organellen zu den Mitochondrien belegen, aber auch ihre Diversität in unterschiedlichen Organismengruppen zeigen.Neocallimastix frontalis, an anaerobic fungus residing in the digestive tract of ruminantia, contains hydrogenosomes—an anaerobic form of mitochondria—instead of “genuine” mitochondria as energy suppling organelles. The common origin of hydrogenosomes and mitochondria has to be shown by the means of new characterising attributes of the hydrogenosomes of N. frontalis. In addition, differences to hydrogenosomes of other organisms have to be found, supporting the polyphyletic genesis of hydrogenosomes. The major aims of this study were to find proof for a common origin of fungal hydrogenosomes and mitochondria and to explore the diversity of hydrogenosomes in different organisms. Polyadenylated RNA was isolated from N. frontalis and used for cDNA synthesis. A cDNA library was constructed. From that, 1615 randomly chosen independent clones were sequenced and annotated by BLAST search against the non redundant protein database of NCBI (National Center for Biotechnology Information). During EST sequencing, colony hybridisations with already sequenced clones were performed to reduce redundant sequencing. The data were stored in a MySQL database reachable via a graphical user interface—written in PHP scripting language—with an internet browser. Hydrogenosomes of N. frontalis were prepared by isopycnic centrifugation. The purity of the hydrogenosomal fraction was evaluated by the enzymatic activities of marker enzymes. The hydrogenosomal proteome was separated by 2D gel electrophoresis (1. dimension pI (IEF), 2. dimension molecular weight (SDS-PAGE)). From these gels about 200 randomly chosen proteins were sequenced and identified by comparison with the contructed EST-database. Two newly identified enzymes were further investigated: pyruvate-formate lyase (PFL, EC: 2.3.1.54) and ornithine carbamoyltransferase (OTC, EC: 2.1.3.3). PFL catalyses the non-oxidative dissimilation of pyruvate to formate and acetyl-CoA, substituting for the position of the pyruvate dehydrogenase complex in the carbon metabolism of aerobic mitochondria. OTC takes part in arginine biosynthesis and is usually localised in the mitochondria of eukaryotes. Here, OTC is identified for the first time in hydrogenosomes. In Trichomonas vaginalis—an anaerobic parasite of the human urogenital tract containing hydrogenosomes as well—OTC takes part in the complete cytosolic arginine dihydrolase pathway and is not found in the hydrogenosomes. In this work two new properties of the hydrogenosomes of N. frontalis were identified, supporting the relationship of these organelles to the mitochondria, but also showing the diversity in different groups of organisms. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Ökologische Pflanzenphysiologie | |||||||
| Dokument erstellt am: | 04.06.2008 | |||||||
| Dateien geändert am: | 04.06.2008 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 24.04.2008 | |||||||
| Datum der Promotion: | 04.06.2008 |
