Dokument: Einfluss von p53 auf die Herzfunktion im Kardiomyozyten-spezifischen AKT-1/2-Doppel-Knockout-Modell
| Titel: | Einfluss von p53 auf die Herzfunktion im Kardiomyozyten-spezifischen AKT-1/2-Doppel-Knockout-Modell | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=74946 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20261111-161740-9 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Deutsch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Friedrichs, Lennart [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof. Dr. Gödecke, Axel [Gutachter] Prof. Dr. rer. nat. Haendeler, Judith [Gutachter] | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften » 610 Medizin und Gesundheit | |||||||
| Beschreibungen: | In einem Mausmodell mit einem induzierbaren, Kardiomyozyten-spezifischen Knockout (KO)
der Proteinkinasen AKT1 und AKT2 (iCMAKT12KO) entwickelt sich nach Induktion des Knockouts eine progrediente Herzinsuffizienz mit kardialer Atrophie, gesteigerter Autophagie und metabolischen Veränderungen, die nach spätestens 28 Tagen letal ist. In einer Transkriptom-Analyse dieser KO-Herzen wurde mittels Ingenuity Pathway Analyse gefunden, dass mit hoher Wahrscheinlichkeit der Transkriptionsfaktor p53 aktiviert war. Interessanterweise entwickeln kardiomyozytenspezifische p53-KO-Mäuse sechs Monate nach Induktion des KO eine kardiale Hypertrophie. Dies führte zur Hypothese, dass eine in iCMAKT12KO-Mäusen erfolgte Aktivierung von p53 zur Entwicklung der Herzinsuffizienz beitragen könnte. Zur Überprüfung dieser Hypothese erfolgte die Zucht und Analyse von Mäusen, die über einen induzierbaren dreifach–KO für AKT1, AKT2 und p53 verfügten. Diese Mäuse (iCMAKT12p53KO) wurden parallel zu iCMAKT12KO, iCM-p53KO und wildtypischen Mäusen (WT) nach KO-Induktion über drei Wochen sequentiell echokardiographisch untersucht. Die Funktionsanalyse ergab, dass sich Atrophie und Funktionseinschränkung der Herzen in den triple-KO Mäusen (iCMAKT12p53KO) vergleichbar zu der Entwicklung in den iCMAKT12KO- Mäusen entwickelten. PCR-Untersuchungen mit kardialer DNA ergaben, dass es nach KO Induktion zur Rekombination im p53-Gen kommt. Da in Herzgewebe neben Kardiomyozyten auch andere Zelltypen wie Endothelzellen und Fibroblasten zu finden sind, in denen keine Rekombination am p53-Gen zu erwarten ist, wurde zur Quantifizierung der KO-Effizienz ein Protokoll zur Isolierung von Kardiomyozyten-Zellkernen über FACS-Sorting etabliert. PCR Analysen an DNA aus angereicherten Kardiomoyzyten-Zellkernen zeigten, dass es nur zu einem partiellen p53-KO kam. Um die Auswirkungen der partiellen p53-Deletion näher zu analysieren, wurden Transkriptomanalysen mit kardialer RNA aus WT, iCMp53KO-, iCMAKT12KO- und iCM AKT12p53KO-Mäusen durchgeführt. Wie in früheren Untersuchungen führte die Inaktivierung von AKT 1 und AKT2 zu massiven Veränderungen im Transkriptom. Interessanterweise waren auch in iCMp53KO-Herzen 733 Transkripte im Vergleich zum WT differentiell reguliert. Eine IPA Analyse zeigte, dass unter den 10 am stärksten regulierten Signalwegen „Cardiac conduction“ (9.2 % des Gensets), „Tp53 regulates metabolic genes“ (9.4%) und „Transcriptional regulation by MecP2“ (11.1 %) herunter reguliert werden und auf einen kardialen Phänotyp hindeuten. Ein direkter Vergleich von iCMAKT12KO und iCMAKT12p53KO ergab lediglich einen signifikanten Unterschied für die MicroRNA Mir450b. Dies zeigt, dass ein partieller kardiomyozytärer p53-Knockout innerhalb des Beobachtungszeitraums von 3 Wochen zu einem milden kardialen Phänotyp im p53-Einzel KO führt. Die durch die kardiomyozytäre AKT-Deletion induzierte kardiale Atrophie kann nicht durch eine partielle Deletion von p53 kompensiert werden, und die Entwicklung der Herzinsuffizienz ist in iCMAKT12p53-Dreifach-Knockout Mäusen im Vergleich zu iCMAKT12KO nicht verlangsamt. Des Weiteren beschäftigte sich die Arbeit mit der Aktivierung von p53 in iCMAKT12KO Herzen. p53 kann durch die Proteinkinasen ATM (ataxia-telangiectasia mutated) und ATR (ATM and Rad3-related) phosphoryliert und so stabilisiert werden. Tatsächlich konnte im Western Blot mit phospho-ATM/ATR-Substrat-spezifischen Antikörpern eine erhöhte Kinaseaktivität in iCMAKT12KO-Herzen nachgewiesen werden. Eine erhöhte Phosphorylierung des spezifischen ATM/ATR-Substrats Histon H2A.X konnte allerdings weder im Western Blot an angereicherten Kardiomyozytenkernen noch in der Immunhistochemie nachgewiesen werden. Es bleibt daher offen, ob die Proteinkinasen ATM/ATR an einer Aktivierung von p53 in iCMAKT12KO-Herzen beteiligt sind.In a mouse model with inducible, cardiomyocyte-specific knockout (KO) of the protein kinases AKT1 and AKT2 (iCMAKT12KO), progressive heart failure develops after induction of the knockout, with cardiac atrophy, increased autophagy, and metabolic changes, which is lethal after 28 or less days. In a transcriptome analysis of these KO hearts, Ingenuity Pathway Analysis revealed that the transcription factor p53 was highly likely to be activated. Interestingly, cardiomyocyte-specific p53 KO mice develop cardiac hypertrophy six months after induction of the KO. This led to the hypothesis that activation of p53 in iCMAKT12KO mice could contribute to the development of heart failure. To test this hypothesis, mice with an iCMAKT12 knockout and an iCMp53 knockout were bred and analyzed. These mice (iCMAKT12p53KO) were examined sequentially by echocardiography over three weeks following KO-induction, in parallel with iCMAKT12KO, iCM-p53KO, and wild-type (WT) mice. Functional analysis revealed that atrophy and functional impairment of the hearts in the triple KO mice (iCMAKT12p53KO) developed similarly to that observed in the iCMAKT12KO mice. PCR analysis of cardiac DNA revealed that recombination occurs in the p53 gene after KO-induction. Since cardiac tissue contains not only cardiomyocytes but also other cell types such as endothelial cells and fibroblasts, in which no recombination at the p53 gene is to be expected, a protocol for isolating cardiomyocyte cell nuclei via FACS sorting was established to quantify KO efficiency. PCR analyses of DNA from enriched cardiomyocyte cell nuclei showed that only partial p53 KO occurred. To analyze the effects of partial p53 deletion in more detail, transcriptome analyses were performed using cardiac RNA from WT, iCMp53KO, iCMAKT12KO, and iCM-AKT12p53KO mice. As in previous studies, the inactivation of AKT 1 and AKT2 led to massive changes in the transcriptome. Interestingly, 733 transcripts were also differentially regulated in iCMp53KO hearts compared to WT. An IPA analysis showed that among the 10 most strongly regulated signaling pathways, “Cardiac conduction” (9.2% of the gene set), “Tp53 regulates metabolic genes” (9.4%), and “Transcriptional regulation by MecP2” (11.1%) were downregulated, indicating a cardiac phenotype. A direct comparison of iCMAKT12KO and iCMAKT12p53KO revealed only one significant difference for the microRNA Mir450b. This shows that partial cardiomyocyte p53 knockout leads to a mild cardiac phenotype in p53 single KO within the observation period of 3 weeks. The cardiac atrophy induced by cardiomyocyte AKT deletion cannot be compensated for by partial deletion of p53, and the development of heart failure is not slowed in iCMAKT12p53 triple knockout mice compared to iCMAKT12KO. Furthermore, the study examined the activation of p53 in iCMAKT12KO hearts. p53 can be phosphorylated and thus stabilized by the protein kinases ATM (ataxia-telangiectasia mutated) and ATR (ATM and Rad3-related). Indeed, Western blot analysis with phospho-ATM/ATR substrate-specific antibodies revealed increased kinase activity in iCMAKT12KO hearts. However, increased phosphorylation of the specific ATM/ATR substrate histone H2A.X could not be detected in Western blot analysis of enriched cardiomyocyte nuclei or in immunohistochemistry. It therefore remains unclear whether the protein kinases ATM/ATR are involved in the activation of p53 in iCMAKT12KO hearts. | |||||||
| Lizenz: |  Dieses Werk ist lizenziert unter einer Creative Commons Namensnennung 4.0 International Lizenz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Medizinische Fakultät » Institute » Institut für Herz- und Kreislaufphysiologie | |||||||
| Dokument erstellt am: | 11.11.2026 | |||||||
| Dateien geändert am: | 11.11.2026 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 09.06.2026 | |||||||
| Datum der Promotion: | 27.10.2026 |
