Dokument: Investigation and Analysis of Post-translational Modifications of the SMN Complex in the snRNP Biogenesis

Titel:	Investigation and Analysis of Post-translational Modifications of the SMN Complex in the snRNP Biogenesis
Weiterer Titel:	Untersuchung und Analyse posttranslationaler Modifikationen des SMN-Komplexes in der snRNP-Biogenese
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=74762
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20261026-125746-7
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Li, Qiaoping [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 23,48 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 20.10.2026 / geändert 20.10.2026
Beitragende:	Prof. Dr. Wesselborg, Sebastian [Gutachter] Prof. Dr. rer. nat. Scheller, Jürgen [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften » 610 Medizin und Gesundheit
Beschreibungen:	Ein gestörter Energiestoffwechsel ist eines der Merkmale von Motoneuron-Erkrankungen (MNDs); sein Einfluss auf die Erkrankungen ist jedoch noch weitgehend ungeklärt. Spinale Muskelatrophie (SMA), eine der MNDs, wird primär durch den Mangel an funktionellem survival of motor neuron (SMN)-Protein verursacht. SMN interagiert mit Gemin2–Gemin8 und Unrip, um den SMN-Komplex zu bilden, welcher eine essenzielle Rolle bei der Biogenese von spliceosomal small nuclear ribonucleoprotein (snRNP) spielt. Die vorliegende Studie konzentriert sich auf die SMN-Phosphorylierung und die Gemin3-Proteolyse, um das Verhalten des SMN-Komplexes unter verschiedenen zellulären Energieniveaus aufzuklären. Eine Energiereduktion wurde durch die Behandlung mit Earle’s balanced salt solution (EBSS) oder bafilomycin A1 (BafA1) induziert. Zellen, die GFP-SMN oder -Gemin3 Wildtyp sowie entsprechende Mutationen überexprimieren, wurden als primäre Modelle verwendet, um die Auswirkungen auf die Interaktion und die Biogenese von snRNP zu untersuchen. Untersucht wurde dies mittels Größenausschlusschromatographie (SEC), Immunpräzipitation (IP) und Immunfluoreszenz (IF). Die Interaktion wurde darüber hinaus durch Pull-down-Assays unter Verwendung von GST-markierten SMN-Phosphomutanten untersucht. Die durch Calpain vermittelte Spaltung wurde in einem In-vitro-Spaltungsassay getestet. Die vorliegenden Ergebnisse zeigten, dass zwei energiesensorische Kinasen, unc-51-like autophagy activating kinase 1 (ULK1) und mammalian target of rapamycin (mTOR), ungeachtet der Nährstoffbedingungen unabhängig vom SMN-Komplex agieren. Eine Reihe von Interaktionsassays zeigte, dass die einfache SMN-Phosphorylierung an Serin (S) 187 dessen Affinität zu SmB verringert und eine duale Phosphorylierung an Threonin (T) 37 und S187 seine Interaktion mit dem Protein Arginine N-Methyltransferase 5 (PRMT5)-Komplex drastisch stört. Die IF ergab ferner, dass die duale Phosphorylierung die Bildung von snRNP behindert. Eine Gemin3-Proteolyse wurde unter basalen Bedingungen beobachtet. Die vorliegende Studie demonstrierte, dass Gemin3 das Substrat von Calpain-1 ist, die basale Spaltung jedoch nicht mit Calpain in Zusammenhang steht. Experimente, die mit Zellen durchgeführt wurden, die trunkiertes GFP-Gemin3 überexprimieren, zeigten unterschiedliche Funktionen der Spaltfragmente auf. Gemin3 wies Eigenschaften von Substraten auf, die über Chaperone-Mediated Autophagy (CMA) abgebaut werden, was darauf hindeutet, dass der basale Abbau von Gemin3 über CMA vermittelt werden könnte. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Biogenese von snRNP durch die SMN-Phosphorylierung an T37 und S187 sowie durch die Gemin3-Proteolyse beeinflusst wird. Der Einfluss von Stoffwechselstörungen auf diese Prozesse könnte zur Entstehung und Progression von SMA und anderen MNDs beitragen. Abnormal energy metabolism is one of the features of motor neuron diseases (MNDs); however, its influence on the diseases remains unclear. Spinal muscular atrophy (SMA), one of MNDs, is primarily caused by the deficiency of functional survival motor neuron (SMN) protein. SMN interacts with Gemin2–Gemin8 and Unrip to form the SMN complex, which plays an essential role in spliceosomal small nuclear ribonucleoprotein (snRNP) biogenesis. The present study focuses on SMN phosphorylation and Gemin3 proteolysis to elucidate the behaviour of the SMN complex under different cellular energy levels. Energy reduction was induced by treatment with Earle’s balanced salt solution (EBSS) or bafilomycin A1 (BafA1). Cells overexpressing GFP-SMN or -Gemin3 wild type and corresponding mutations were used as primary models to examine the impact on interaction and snRNP biogenesis measured via size exclusion chromatography (SEC), immunoprecipitation (IP) and immunofluorescence (IF). The interaction was further investigated via pull-down assays using GST-tagged SMN phospho-mutants. The calpain-mediated cleavage was tested by in vitro cleavage assay. The present findings revealed that two energy-sensing kinases, unc-51-like autophagy activating kinase 1 (ULK1) and mammalian target of rapamycin (mTOR), function independently of the SMN complex regardless of the nutrient conditions. A series of interaction assays showed that SMN single phosphorylation at serine (S)187 reduces its affinity with SmB, and dual phosphorylation at threonine (T) 37 and S187 strikingly disrupts its interaction with the protein arginine N-methyltransferase 5 (PRMT5) complex. IF further revealed that dual phosphorylation impedes the formation of snRNP. Gemin3 proteolysis was observed under basal conditions. The present study demonstrated that Gemin3 is the substrate of calpain-1, but the basal cleavage is not related to calpain. Assays performing with cells overexpressing truncated GFP-Gemin3 revealed distinct functions of the cleavage fragments. Gemin3 exhibited characteristics of the substrates degraded via chaperone-mediated autophagy (CMA), suggesting that the basal turnover of Gemin3 could be mediated via CMA. In summary, snRNP biogenesis is affected by SMN phosphorylation at T37 and S187, and Gemin3 proteolysis. The influence of metabolism disorders on these events might contribute to the development and progression of SMA and other MNDs.
Lizenz:	Dieses Werk ist lizenziert unter einer Creative Commons Namensnennung 4.0 International Lizenz
Fachbereich / Einrichtung:	Medizinische Fakultät
Dokument erstellt am:	26.10.2026
Dateien geändert am:	26.10.2026
Promotionsantrag am:	25.06.2026
Datum der Promotion:	14.10.2026