Dokument: Establishment of a qPCR Assay for the Detection and Quantification of Mycobacterium fortuitum DNA : Application to Sputum Samples from Patients with Suspected Nontuberculous Mycobacterial Infection in Ghana
| Titel: | Establishment of a qPCR Assay for the Detection and Quantification of Mycobacterium fortuitum DNA : Application to Sputum Samples from Patients with Suspected Nontuberculous Mycobacterial Infection in Ghana | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=74482 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20260928-103201-7 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Englisch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Stiegler, Hugo Yoshi [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof. Dr. Jacobsen, Marc [Gutachter] Univ.-Prof. Dr. med. Timm Jörg [Gutachter] | |||||||
| Stichwörter: | NTM, TB, Ghana, Mycobacteria | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften » 610 Medizin und Gesundheit | |||||||
| Beschreibungen: | Non-tuberculous mycobacteria (NTM) can cause pulmonary disease, which is clinically very similar to pulmonary tuberculosis (TB). Worldwide, up to 10 million people are infected with TB and 1.5 million die annually. Although the prevalence of NTM infections is much lower, it has been rising continually over the past years. Pulmonary disease with NTM is difficult to distinguish diagnostically from TB. This poses an especial problem in regions with a high incidence of TB, such as the countries in sub-Saharan Africa. A pilot study conducted by our research group found M. fortuitum to be the most commonly isolated NTM in presumptive TB patients throughout Ghana, a finding supported by other literature. In contrast to TB, few options for diagnosing NTM infections exist. In resource-limited settings, even less methods are available for differential diagnosis of presumptive TB patients. However, correctly distinguishing between the two infections is crucial for patients, as therapeutic approaches differ significantly. Molecular biological methods such as qPCR may enable a rapid and reliable diagnosis of infections with NTM, for example from sputum or culture samples. We designed custom primers and probes for M. fortuitum and M. tuberculosis targeting the rpoB gene and the IS6110 respectively. As part of this study several DNA extraction methods were compared and a quantitative PCR assay to identify M. fortuitum from culture samples was developed. Two promising methods for the extraction of mycobacterial DNA were identified. Key components of the protocols were the use of 1) Chelex® resin, thermal degradation and ultrasonication, 2) Tween lysis buffer, Proteinase K and lysozyme digestion and repeated thermal degradation. Detection methods achieved a high overall agreement between our M. fortuitum qPCR assay and the GenoType CM LPA reference method when testing DNA extracted from sputum culture samples. The limit of detection of our M. fortuitum qPCR assay was between 102 and 103 CFU/ml. When using the Chelex® DNA extraction protocol and our IS6110 qPCR assay on sputum samples from presumptive TB patients, initial experiments suggested high sensitivity and specificity. To summarize, our results elucidate possible molecular biological methods for the identification of M. fortuitum. For a comprehensive understanding of the epidemiologic and pathogenetic relevance of M. fortuitum in Ghana, WGS of our samples would be an important next step.Nicht-tuberkulöse-Mykobakterien (NTM) können eine Lungenerkrankung auslösen, die der weltweit grassierenden Lungentuberkulose (TB) sehr ähnlich ist. Jährlich erkranken ca. 10 Millionen Menschen an TB und 1.5 Millionen versterben. Die Prävalenz von NTM-Lungenerkrankungen ist zwar weit niedriger, dennoch ist sie in den letzten Jahrzehnten kontinuierlich angestiegen und stellt somit ein ernstzunehmendes Problem dar. Klinisch und diagnostisch sind Lungenerkrankungen mit TB und NTM schwer voneinander zu unterscheiden. Vor allem in Ländern mit hoher TB-Inzidenz und limitierten labordiagnostischen Ressourcen besteht somit das Risiko, dass NTM-Lungenerkrankungen übersehen und als TB fehldiagnostiziert werden. Eine korrekte Differenzierung beider Erkrankungen ist allerdings von hoher Relevanz für die Therapie und weitere Prognose, da die Erreger der NTM-Lungenerkrankungen häufig resistent gegen bei der TB eingesetzten Medikamente sind. Eine Pilotstudie unserer Arbeitsgruppe in Ghana kam zu dem Ergebnis, dass dort M. fortuitum das häufigste NTM bei Patienten mit TB-Verdacht ist. Ähnliche Befunde liegen aus anderen Studien in Afrika vor. Molekularbiologische Verfahren wie quantitative PCR (qPCR) können dazu beitragen, eine schnelle und sichere Diagnose von NTM z.B. aus Sputum oder Kultur, zu ermöglichen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden ein quantitatives PCR Assay und DNA-Extraktionsverfahren entwickelt, um M. fortuitum aus Patientenproben nachweisen zu können und somit die Differenzierung zu TB zu erleichtern. Als Zielregion für die qPCR dienten das rpoB Gen bei M. fortuitum und das Gen/Sequenz IS6110 bei M. tuberculosis. Wir verglichen zudem mehrere DNA-Extraktionsmethoden und identifizierten zwei aussichtsreiche Protokolle zur Extraktion mycobakterieller DNA. Die Schlüsselkomponenten der beiden Methoden waren die Nutzung von 1) Chelex® Resin und einem Ultraschallwasserbad, sowie 2) Tween Lyse Puffer, Proteinase K und Lysozym sowie mehreren Koch- und Frier-Zyklen. Andere getestete Methoden erwiesen sich als weniger effektiv. Beim Vergleich der Nachweismethoden wurde bei der Testung von Sputum Kulturen eine hohe Übereinstimmung/Kongruenz zwischen dem M. fortuitum qPCR Assay und der Referenzmethode GenoType CM LPA erzielt. Die Nachweisgrenze des M. fortuitum qPCR Assay wurde mit 102 bis 103 CFU/ml bestimmt. Bei der direkten Testung von Sputum Proben mittels unserem M. tuberculosis qPCR Assay und der Referenzmethode GeneXpert® Xpert® MTB/RIF Ultra legten erste Experimente eine hohe Sensitivität und Spezifität nahe. Zusammenfassend zeigt unsere Arbeit neue molekularbiologische Methoden zur Identifizierung von M. fortuitum auf. Zum genaueren Verständnis der Epidemiologie und pathogenetischen Relevanz von M. fortuitum in Ghana wäre eine Genomsequenzierung unserer Proben ein wichtiger nächster Schritt. | |||||||
| Lizenz: |  Dieses Werk ist lizenziert unter einer Creative Commons Namensnennung 4.0 International Lizenz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Medizinische Fakultät | |||||||
| Dokument erstellt am: | 28.09.2026 | |||||||
| Dateien geändert am: | 28.09.2026 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 04.06.2026 | |||||||
| Datum der Promotion: | 08.09.2026 |
