Dokument: Enforced alteration of sugar uptake and metabolism in Corynebacterium glutamicum and application for the production of the natural low-calorie sweetener D-allulose
| Titel: | Enforced alteration of sugar uptake and metabolism in Corynebacterium glutamicum and application for the production of the natural low-calorie sweetener D-allulose | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=74414 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20261026-125129-4 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Englisch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Lehnert, Alexander [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof. Dr. Bott, Michael [Gutachter] Prof. Dr. Holger Gohlke [Gutachter] | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie | |||||||
| Beschreibungen: | In an increasingly obese world population, where gaining weight is in close association with the consumption of high-calorie sweeteners such as D-sucrose or high-fructose corn syrup, low-calorie sweeteners have attracted great public and economic interest. What once started with the synthesis of saccharine in 1879 has developed into an ever-growing market that includes products such as polyols, oligosaccharides and even proteins as alternative sweeteners. A comparatively new sweetener is the rare natural sugar D-allulose, which is not only low in calories (0.2 kcal/g) and similarly sweet as D-sucrose, but, in contrast to other alternative sweeteners, also has anti-hyperglycemic and anti-hyperlipidemic effects. Although D-allulose has great potential to replace conventional high-calorie sweeteners, its industrial biotechnological production in fixed-bed reactors with purified D-allulose- or D-tagatose 3-epimerases converting D-fructose to D-allulose is comparatively expensive. The aim of this work was to develop an alternative fermentative process for D-allulose production from D-glucose using the industrial cell factory Corynebacterium glutamicum.
For the production of D-allulose from D-glucose, a xylose isomerase (XylA) converting D-glucose to D-fructose was required. Using the selection strain Fruneg, whose growth on D-fructose was strictly dependent on XylA activity, and adaptive laboratory evolution (ALE), a XylA variant with strongly enhanced catalytic efficiency at 30°C was obtained. In addition, ALE also strongly improved the uptake of D-fructose by mutations in the promiscuous inositol transporter IolT1. Conversion of the Fruneg strain into a Gluneg strain unable to catabolize D-glucose required not only the deletion of glucokinases, but also of the D-glucose-oxidizing inositol dehydrogenases and the sucrose transporter PtsS, which apparently was also able to co-transport glucose and fructose. The Gluneg strain expressing the evolved XylA and IolT1 variants and a suitable D-allulose 3-epimerase was able to produce D-allulose from D-glucose with a yield of 15%, which is similar to the one obtained with immobilized enzymes. As an alternative to the epimerase-based process, the production of D-allulose via the phosphorylation-dephosphorylation pathway was established in C. glutamicum by expression of a suitable fructokinase, D-allulose 6-phosphate 3-epimerase (AlsE) and D-allulose 6-phosphate phosphatase (AlsP). However, this assumed irreversible pathway turned out to be reversible due to D-allulose phosphorylation by fructokinase and an AlsE side-reaction catalyzing the epimerization of D-allulose to D-fructose. Due to these obstacles, only allulose yields below 10% were obtained with D-glucose, D-fructose or D-sucrose as substrate.Das Problem einer zunehmend übergewichtigen Weltbevölkerung steht in engem Zusammenhang mit dem Konsum kalorienreicher Süßstoffe wie D-Saccharose oder Maissirup. Ihr Ersatz durch kalorienarme Süßungsmittel ist daher von großem öffentlichen und wirtschaftlichen Interesse. Was mit der Synthese von Saccharin im Jahr 1879 begann, hat sich zu einem ständig wachsenden Markt entwickelt, der Produkte wie Polyole, Oligosaccharide und sogar Proteine als alternative Süßungsmittel umfasst. Ein vergleichsweise neues Süßungsmittel ist der seltene natürliche Zucker D-Allulose, der nicht nur kalorienarm (0,2 kcal/g) und ähnlich süß wie D-Saccharose ist, sondern im Gegensatz zu anderen alternativen Süßungsmitteln auch antihyperglykämisch und antihyperlipidämisch wirkt. Allerdings ist die industrielle biotechnologische Herstellung von D-Allulose in Festbettreaktoren mit gereinigten D-Allulose- oder D-Tagatose-3-Epimerasen, die D-Fructose in D-Allulose umwandeln, vergleichsweise teuer. Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung eines alternativen fermentativen Verfahrens zur D-Allulose-Produktion aus D-Glucose unter Verwendung der industriellen Zellfabrik Corynebacterium glutamicum. Dafür war eine Xylose-Isomerase (XylA) erforderlich, die D-Glucose in D-Fructose umwandelt. Mit Hilfe des Selektionsstamms Fruneg, dessen Wachstum auf Fructose strikt von der XylA-Aktivität abhing, und adaptiver Laborevolution (ALE) wurde eine XylA-Variante mit stark verbesserter katalytischer Effizienz bei 30°C erhalten. Darüber verbesserte ALE auch die D-Fructose-Aufnahme durch Mutationen im Inositol-Transporter IolT1. Die Weiter-entwicklung des Fruneg- in einen Gluneg-Stamm, der keine Glucose verstoffwechseln kann, erforderte nicht nur die Deletion der Glucokinasen, sondern auch der D-Glucose-oxidierenden Inositol-Dehydrogenasen und des Saccharose-Transporters PtsS, der offenbar auch D-Glucose und D-Fructose cotransportieren kann. Ein Gluneg-Stamm, der die evolvierten XylA- und IolT1-Varianten sowie eine D-Allulose-3-Epimerase exprimierte, produzierte D-Allulose aus D-Glucose mit einer Ausbeute von 15%, vergleichbar zum Prozess mit isolierten Enzymen. Als Alternative wurde die D-Allulose-Produktion über phosphorylierte Intermediate durch Expression einer geeigneten Fructokinase, D-Allulose-6-Phosphat-3-Epimerase (AlsE) und D-Allulose-6-Phosphat-Phosphatase (AlsP) in C. glutamicum etabliert. Dieser theoretisch irreversible Weg erwies sich jedoch aufgrund der Phosphorylierung von D-Allulose durch Fructokinase und der Epimerisierung von D-Allulose zu D-Fructose durch eine Nebenreaktion von AlsE als reversibel. Aufgrund dieser Hindernisse wurden mit D-Glucose, D-Fructose oder D-Sucrose als Substrat nur D-Allulose-Ausbeuten unter 10% erzielt. | |||||||
| Lizenz: |  Dieses Werk ist lizenziert unter einer Creative Commons Namensnennung 4.0 International Lizenz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Sonstige Einrichtungen/Externe » Institute in Zusammenarbeit mit der Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf » Institut für Biotechnologie, Forschungszentrum Jülich GmbH | |||||||
| Dokument erstellt am: | 26.10.2026 | |||||||
| Dateien geändert am: | 26.10.2026 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 19.12.2024 | |||||||
| Datum der Promotion: | 16.12.2025 |
