Dokument: Aktivierungsmuster muskulärer C2C12- sowie hepatischer Hepa1-6- und HepG2-Zellen durch IL-6- und IL-12-artige Zytokine sowie Cytokimera mit Neugeneration zweier Chimäre
| Titel: | Aktivierungsmuster muskulärer C2C12- sowie hepatischer Hepa1-6- und HepG2-Zellen durch IL-6- und IL-12-artige Zytokine sowie Cytokimera mit Neugeneration zweier Chimäre | |||||||
| Weiterer Titel: | Activation patterns of muscular C2C12 cells and hepatic Hepa1-6 and HepG2 cells by IL-6- and IL-12-like cytokines and Cytokimera and generation of two novel chimeras | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=74401 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20260907-112643-9 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Deutsch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Youssef, Nadine Julia [Autor] | |||||||
| Dateien: |
| |||||||
| Beitragende: | Prof. Dr. Jürgen Scheller [Gutachter] Prof. Dr. Hadi Al-Hasani [Gutachter] | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften » 610 Medizin und Gesundheit | |||||||
| Beschreibungen: | Zytokine sind Botenstoffe, die die interzelluläre Kommunikation sowie Zellproliferation und -differenzierung regulieren. Das im Zentrum dieser Arbeit stehende Interleukin-6 (IL-6) ist insbesondere aufgrund seiner zentralen Rolle im Entzündungsgeschehen von Bedeutung. Neben seinen überwiegend proinflammatorischen Eigenschaften wurden in den letzten Jahren zunehmend metabolische Effekte charakterisiert. Kurzfristige, lokale IL-6-Bildung im Rahmen körperlicher Aktivität vermittelt positive metabolische Effekte, darunter eine Senkung des Blutzuckerspiegels, eine gesteigerte Insulinsensitivität und eine erhöhte Lipolyse. Demgegenüber trägt chronisch gebildetes IL-6, wie dies beim Typ-2-Diabetes mellitus vorliegt, zu einer anhaltenden metabolischen Entzündung („Meta-Inflammation“) bei und fördert die Krankheitsprogression.
Kallen et al. entwickelten 1999 das Designerzytokin IC7. Findeisen et al. modifizierten IC7 mit dem Ziel einer therapeutischen Anwendung beim Typ-2-Diabetes. IC7 ist ein Chimär aus IL-6 und Ciliary Neurotrophic Factor (CNTF), bei dem die Bindestelle III des IL-6, welche ursprünglich mit dem transmembranären Glykoprotein 130 (gp130) interagiert, strukturbasiert durch den entsprechenden Struktur-homologen Abschnitt von CNTF, welcher nativ den LIF-Rezeptor (LIFR, Leukemia inhibitory factor Receptor) bindet, ersetzt wurde. Dadurch adressiert IC7 die neuartige, nicht-natürliche Rezeptorkonstellation IL-6Rα/gp130/LIFR auf der Zielzelle. CNTF gehört – ebenso wie IL-6, IL-11, LIF und Oncostatin M (OSM) – zur IL-6-Zytokinfamilie. Ziel dieser Arbeit war die Generierung und Charakterisierung neuartiger chimärer Zytokine (pIL35 und pIL19), die strukturelle Elemente der IL-6- und der IL-12-Zytokinfamilie kombinieren. Darüber hinaus sollten bereits entwickelte Chimäre (GIL-6, GIO-6, GIL-11) auf metabolisch relevanten Zelllinien weiter charakterisiert werden (murine C2C12-Myoblasten, murine Hepa1-6-Hepatomzellen sowie humane HepG2-Hepatomzellen). GIL-6, GIO-6 und GIL-11 bestehen jeweils aus IL-6 in Kombination mit LIF, OSM bzw. IL-11; analog zu IC7 erfolgte ein strukturbasierter Austausch der Bindestelle III. Beim Design von pIL35 und pIL19 wurde, ebenfalls analog zu IC7, die Bindestelle III des IL-6 durch p35 bzw. p19, die α-Untereinheiten von IL-12 bzw. IL-23, ersetzt. IL-12 und IL-23 sind Mitglieder der IL-12-Zytokinfamilie. Die resultierenden Chimären sollten neue Rezeptorkomplexe adressieren: Für pIL35 wurde die Interaktion mit IL-6Rα/gp130/IL-12Rβ2 angestrebt, für pIL19 mit IL-6Rα/gp130/IL-23R. Die Expression erfolgte zunächst in HEK293T-Zellen, anschließend in Expi293-Zellen. Die Reinigung der Fc-Fusionsproteine wurde mittels Protein-A-Chromatographie durchgeführt. Zur Untersuchung der biologischen Aktivität wurden murine prä-B-Zellen (Ba/F3) verwendet, in die die erforderlichen humanen Rezeptoren zuvor durch retrovirale Transduktion stabil integriert worden waren. Proliferations- und Stimulationsassays zeigten keine biologische Aktivität der Chimären pIL35 und pIL19. Nachfolgende Analysen der Bindungskinetik mittels Immunpräzipitation und Oberflächenplasmonenresonanzspektroskopie belegten jedoch die Bindung von pIL35 an den IL-6-Rezeptor. Die Affinität von pIL35 (KD = 26,54 nM) war mit der von natürlichem IL-6 an den IL-6R (KD=27,47 nM) vergleichbar. Zur Vorbereitung funktioneller metabolischer Analysen der Chimären GIL-6, GIO-6 und GIL-11 wurden C2C12-, Hepa1-6- und HepG2-Zellen hinsichtlich ihrer Rezeptorexpression charakterisiert, um geeignete Zelllinien für angestrebte Seahorse-Assays zu identifizieren. In Stimulationsassays konnte auf allen drei Zelllinien eine Oberflächenexpression des LIFR nachgewiesen werden. Eine Expression des OSMR erscheint wahrscheinlich, konnte jedoch aufgrund der Rezeptor-Promiskuität von OSM (Bindung an OSMR und LIFR) nicht eindeutig bestätigt werden. Differenzierte C2C12-Zellen (ab Tag 5) sowie HepG2-Zellen exprimieren IL-6Rα; HepG2- und Hepa1-6-Wildtypzellen zeigen zudem eine IL-11Rα-Expression. HepG2-Zellen sind somit durch IC7, GIL-6, GIO-6 und GIL-11 stimulierbar und für Seahorse-Analysen geeignet. Zur Ermöglichung einer Stimulierbarkeit der Hepa1-6-Zellen durch GIL-6, GIO-6 und GIL-11 wurde die cDNA kodierend für den IL-6R transient sowie stabil eingebracht. Die neu etablierte stabile Zelllinie Hepa1-6(hIL-6R) stellt damit ebenfalls ein geeignetes Modell für metabolische Analysen dar. Zusammenfassend konnte trotz fehlender biologischer Aktivität der neu generierten Chimären ein Erkenntnisgewinn hinsichtlich der Ligand-Rezeptor-Interaktionen erzielt werden. Zudem stehen mit HepG2 und Hepa1-6(hIL-6R) zwei geeignete Zellmodelle für die weiterführende funktionelle Charakterisierung der aktiven Designerzytokine zur Verfügung.Cytokines are signalling molecules that regulate intercellular communication as well as cell proliferation and differentiation. Interleukin-6 (IL-6), which is the focus of this work, is of particular importance due to its central role in inflammatory processes. In addition to its predominantly proinflammatory properties, metabolic effects of IL-6 have been increasingly characterized in recent years. Transient elevations of IL-6 during physical exercise mediate beneficial metabolic effects, including reduced blood glucose levels, enhanced insulin sensitivity, and increased lipolysis. In contrast, chronically elevated IL-6 concentrations, as observed in type 2 diabetes mellitus, contribute to persistent metabolic inflammation (“meta-inflammation”) and promote disease progression. In 1999, Kallen et al. designed the cytokine IC7. Findeisen et al. subsequently modified IC7 with the aim of therapeutic application in type 2 diabetes. IC7 is a chimera composed of IL-6 and Ciliary Neurotrophic Factor (CNTF), in which binding site III of IL-6, which actually binds gp130, was structurally replaced by the corresponding region of CNTF, that naturally binds the LIFR (Leukemia Inhibitory Factor Receptor). As a result, IC7 engages a novel receptor complex consisting of IL-6Rα/gp130/LIFR on target cells. CNTF belongs to the IL-6 cytokine family, which also includes IL-6, IL-11, LIF, and Oncostatin M (OSM). The aim of this study was the generation and characterization of novel chimeric cytokines (pIL35 and pIL19) combining structural elements of the IL-6 and IL-12 cytokine families. In addition, previously developed chimeras (GIL-6, GIO-6, and GIL-11) were further characterized in metabolically relevant cell lines (murine C2C12 myoblasts, murine Hepa1-6 hepatoma cells, and human HepG2 hepatoma cells). GIL-6, GIO-6, and GIL-11 consist of IL-6 fused to LIF, OSM, or IL-11, respectively; analogous to IC7, binding site III was structurally exchanged. For the design of pIL35 and pIL19, binding site III of IL-6 was replaced, again analogous to IC7, by p35 or p19, the α-subunits of IL-12 and IL-23, respectively. IL-12 and IL-23 are members of the IL-12 cytokine family. The resulting chimeras were designed to engage novel receptor complexes: IL-6Rα/gp130/IL-12Rβ2 for pIL35 and IL-6Rα/gp130/IL-23R for pIL19. Expression was initially performed in HEK293T cells and subsequently in Expi293 cells. The Fc-fusion proteins were purified by protein A chromatography. Biological activity was assessed using murine pre-B cells (Ba/F3), in which the required human receptors had been stably integrated via retroviral transduction. Proliferation and stimulation assays demonstrated no biological activity of the chimeric cytokines. However, subsequent binding analyses using immunoprecipitation and surface plasmon resonance confirmed binding of pIL35 to the IL-6 receptor. The binding affinity of pIL35 (KD = 26.54 nM) was comparable to that of native IL-6 binding to IL-6R (KD = 27.47 nM). To prepare for functional metabolic analyses of GIL-6, GIO-6, and GIL-11, C2C12, Hepa1-6, and HepG2 cells were characterized with respect to receptor expression to identify suitable models for intended Seahorse assays. Surface expression of LIFR was confirmed in all three cell lines. Expression of OSMR was considered likely but could not be conclusively demonstrated due to the receptor promiscuity of OSM, which binds both OSMR and LIFR. Differentiated C2C12 cells (from day 5) and HepG2 cells expressed IL-6Rα; HepG2 and Hepa1-6 wild-type cells additionally expressed IL-11Rα. Consequently, HepG2 cells are responsive to IC7, GIL-6, GIO-6, and GIL-11 and are suitable for Seahorse analyses. To enable stimulation of Hepa1-6 cells by GIL-6, GIO-6, and GIL-11, IL-6R was introduced transiently as well as stably. The newly established stable Hepa1-6(hIL-6R) cell line therefore represents an additional suitable model for metabolic analyses. In summary, although the newly generated chimeras did not exhibit biological activity, this work provides important insights into ligand-receptor interactions. Furthermore, two suitable cellular models (HepG2 and Hepa1-6(hIL-6R)) are now available for the continued functional characterization of designer cytokines. | |||||||
| Lizenz: |  Dieses Werk ist lizenziert unter einer Creative Commons Namensnennung 4.0 International Lizenz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Medizinische Fakultät » Institute » Institut für Biochemie und Molekularbiologie II | |||||||
| Dokument erstellt am: | 07.09.2026 | |||||||
| Dateien geändert am: | 07.09.2026 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 24.03.2026 | |||||||
| Datum der Promotion: | 25.08.2026 |
