Dokument: Online Coupling of Liquid Chromatography to Raman Spectroscopic Detection for the Analysis of Proteins and Other Biopharmaceutical Products

Titel:	Online Coupling of Liquid Chromatography to Raman Spectroscopic Detection for the Analysis of Proteins and Other Biopharmaceutical Products
Weiterer Titel:	Online-Kopplung von Flüssigkeitschromatographie und Raman-spektroskopischer Detektion zur Analyse von Proteinen und anderen biopharmazeutischen Produkten
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=74339
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20260914-112329-9
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Thißen, Jana [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 3,29 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 01.09.2026 / geändert 01.09.2026
Beitragende:	Breitkreutz, Jörg [Gutachter] Hacker, Michael C. [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften » 610 Medizin und Gesundheit
Beschreibungen:	Die Kopplung der Flüssigkeitschromatographie (LC) mit unterschiedlichen spektroskopischen Methoden wie beispielsweise der UV/Vis-Spektroskopie ist seit den 1980er Jahren gängige Praxis. Jedoch gibt es bis heute nur relativ wenige Studien zu einer Online-Kopplung aus LC und Raman Spektroskopie (RS). Dabei ermöglicht die RS insbesondere im Bereich der Proteinanalytik selektive Informationen zur Konformation und zu den Strukturelementen von Proteinen, die unter nativen Bedingungen zerstörungs- und markierungsfrei analysiert werden können. Im Rahmen von bisherigen Studien wurden hauptsächlich reine Substanzen oder Mischungen daraus mittels RS-Detektion nach chromatographischer Trennung analysiert, jedoch kaum reale Proben. Der Fokus dieser Arbeit lag daher auf der Erforschung der Möglichkeiten und Grenzen einer Online-Kopplung aus LC und RS zur Untersuchung von Proteinen und ihren prosthetischen Gruppen in biopharmazeutischen oder biologischen Proben, wobei verschiedene bioanalytische Fragestellungen adressiert werden sollten. Die Größenausschlusschromatographie (SEC) wurde aufgrund ihrer Relevanz in der Charakterisierung von Biopharmazeutika als Trenntechnik zur Kopplung ausgewählt. Die wässrigen Pufferlösungen zur Elution der SEC bieten native Bedingungen für Proteine und sind kompatibel mit der RS-Detektion. Im Rahmen der durchgeführten Arbeiten wurden Proteine in biopharmazeutischen Arzneimitteln und hämolysiertem Serum hinsichtlich ihrer Struktur untersucht, identifiziert und differenziert. Zusätzlich wurden die Aspekte der automatisierten Datenauswertung und Bewertung von spektralen Unterschieden bzw. Übereinstimmungen sowie die Quantifizierung von funktionalen Hilfsstoffen in einem Biopharmazeutikum im Rahmen der Arbeit untersucht. Der Aufbau des gekoppelten Systems wurde detailliert beschrieben und dabei der Ausdruck „kapillar-verstärkte Raman Spektroskopie (CERS)“ für das Detektionssystem geprägt. Die Online-Kopplung SEC-CERS konnte erfolgreich zur Strukturaufklärung, Identifizierung und Unterscheidung verschiedener Proteine in unterschiedlichen Proben wie Biopharmazeutika oder Blutserum eingesetzt werden. SEC-CERS eignete sich zur simultanen Bestimmung der Konformation von therapeutischen Proteinen und zur Quantifizierung von funktionalen Hilfsstoffen in Biopharmazeutika, was zur umfangreichen Charakterisierung von Biopharmazeutika seitens der regulatorischen Behörden beitragen kann. Zusätzlich konnten die Biomarker Serumalbumin, Immunglobulin G und Hämoglobin erfolgreich in hämolysiertem Serum identifiziert werden. Jedoch zeigte sich, dass die Konzentration der analysierten Proteine ausreichend hoch sein muss. Somit konnten biopharmazeutische Arzneiformen analysiert werden, während in Serum nur die in höherer Konzentration auftretenden Proteine zugänglich waren. Drei IgG1 Antikörper konnten als einzelne Wirkstoffe sowie unter Berücksichtigung der Formulierung durch automatisierte Datenauswertung und den Einsatz einer Hauptkomponentenanalyse voneinander unterschieden werden, wodurch ein weiteres potenzielles Anwendungsfeld in der pharmazeutischen Qualitätskontrolle mit der Erkennung von Unterschieden bzw. der Identifizierung von Ähnlichkeiten zwischen Proteinproben adressiert werden konnte. Zusammenfassend konnten im Rahmen dieser Arbeit verschiedene praktische Anwendungsbeispiele aus dem Bereich der Proteinanalytik mit SEC-CERS adressiert werden, was einen wesentlichen Beitrag zur Forschung im Bereich der RS-Detektion für die LC darstellt. Coupling of liquid chromatography (LC) with various spectroscopic methods such as UV/Vis spectroscopy has been common practice since the 1980s. However, to date, relatively few studies have investigated the online coupling of LC with Raman spectroscopy (RS). In particular, RS provides selective information on the conformation and structural elements of proteins, enabling non-destructive and label-free analysis of proteins under native conditions. In recent studies, mainly pure substances or mixtures of selected analytes were analyzed by RS detection after chromatographic separation, rather than compounds in a complex matrix. Therefore, the focus of this work was to examine the possibilities and limitations of online coupling LC with RS for analyzing proteins and their prosthetic groups in biopharmaceutical or biological samples, thereby addressing various bioanalytical questions. Size exclusion chromatography (SEC) was chosen as separation technique for coupling due to its relevance in the characterization of biopharmaceuticals. The aqueous buffer solutions used for SEC elution provide native conditions for proteins and are highly compatible with RS detection. Within the scope of this work, proteins in biopharmaceutical drugs and hemolyzed serum were examined, identified, and differentiated based on their structure. In addition, automated data evaluation and assessment of spectral differences and similarities, as well as the quantification of functional excipients in a biopharmaceutical formulation were investigated. The setup of the coupled system was described in detail, and the term capillary-enhanced Raman spectroscopy (CERS) was coined for the detection system. The online coupling SEC-CERS was successfully applied to the structural elucidation, identification, and differentiation of various proteins in different samples, such as biopharmaceuticals and blood serum. SEC-CERS was suitable for the simultaneous determination of the conformation of therapeutic proteins and the quantification of functional excipients in biopharmaceuticals, which can contribute to the comprehensive characterization of biopharmaceuticals required by regulatory authorities. Furthermore, the biomarkers serum albumin, immunoglobulin G, and hemoglobin were successfully identified in hemolyzed serum. However, a limitation is that protein concentration must be sufficiently high for analysis. Thus, while biopharmaceutical formulations could be analyzed, only high abundance proteins were accessible in serum. Automated data evaluation and principal component analysis enabled differentiation of three IgG1 antibodies as individual active substances as well as in their formulations, thereby demonstrating another potential application in pharmaceutical quality control by detecting differences between protein samples or identifying similarities. In summary, this thesis addresses several practical application examples in the field of protein analysis using SEC-CERS, which demonstrates a significant research contribution in the field of RS detection for LC.
Lizenz:	Dieses Werk ist lizenziert unter einer Creative Commons Namensnennung 4.0 International Lizenz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Pharmazie » Pharmazeutische Technologie und Biopharmazie
Dokument erstellt am:	14.09.2026
Dateien geändert am:	14.09.2026
Promotionsantrag am:	11.02.2026
Datum der Promotion:	19.08.2026