Dokument: Heterologous Expression and Protein Engineering of Unspecific Peroxygenases
| Titel: | Heterologous Expression and Protein Engineering of Unspecific Peroxygenases | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=74107 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20260914-085138-3 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Englisch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Schmitz, Fabian [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof. Dr. Urlacher, Vlada B. [Gutachter] Apl. Prof. Dr. Pohl, Martina [Gutachter] | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie | |||||||
| Beschreibungen: | In 2004, the research group led by Martin Hofrichter firstly described a novel group of fungal oxidoreductases found in the basidiomycetous fungus Agrocybe aegerita. These later were re-classified as unspecific peroxygenases (UPOs). Containing a heme as prosthetic group, UPOs can utilize hydrogen peroxide as electron acceptor and oxygen donor to oxyfunctionalize a broad range of aliphatic and aromatic substrates. Thereby, UPOs show a unique dual-catalytic reaction mechanism with the combination of the reaction cycle of classic peroxidases and the peroxide ‘shunt’ pathway of cytochrome P450 monooxygenases (P450s). While both UPOs and P450s are able to catalyze selective oxygen transfer to organic substrates, UPOs do not rely on expensive redox partners, such as nicotinamide-adenine dinucleotides (NAD(P)H). This advantage makes UPOs an interesting candidate to increase the ‘biocatalytic toolbox’.
Despite the evident potential of UPOs as catalysts for oxyfunctionalization reactions, research into this enzyme group remains in its early stages. A significant challenge to progress in this field is the complexity of heterologous expression in recombinant hosts. To date, only over 50 (out of over 4500 putative) UPOs have been heterologously expressed and described, placing them significantly behind the well-characterized P450s. Research efforts have thus far focused predominantly on the identification and characterization of novel UPOs and their native substrate scopes. In contrast, protein engineering approaches remain limited, with only a few studies exploring the modification of UPOs. Consequently, the comprehension of how amino acid residues within the active site or the heme access channel influence stereo- and chemoselectivity remains at an early stage. Further, only a few examples are described for the up-scaling of UPO catalyzed reactions towards industrial scale. To address these open challenges, this thesis started with the search and identification of novel putative UPO genes. Based on a comprehensive BLAST database search, seven putative UPO genes were selected and expressed in the recombinant yeast Pichia pastoris, recently reclassified as Komagataella phaffii, under the control of the methanol inducible AOX1p promoter. Among these seven putative UPO genes, AbrUPO from Aspergillus brasiliensis was the only one showing a relatively high volumetric activity of 93.0 U l-1 towards 2,2′-Azino-di(3-ethyl-benzthiazolin-6-sulfonsäure) (ABTS). Subsequently, AbrUPO was selected for a fed-batch cultivation in a 7.5 l bioreactor, where AbrUPO was produced with a yield of ~750 mg l-1 active enzyme, which was the highest yield of a wildtype UPO to date. The purified enzyme showed a comparable pH and thermal stability compared to other described UPOs, such as the evolved PaDa-I variant from AaeUPO from Agrocybe aegerita. Nevertheless, AbrUPO showed a lower stability in organic solvents compared to PaDa-I. After this biochemical characterization, AbrUPOs catalytic possibilities were tested towards diverse substrates, containing substituted benzenes and phenols, sulphides, terpenes, terpenoids and fatty acids. Within this substrate screening it became evident that, unlike other UPOs, AbrUPO was able to catalyze aromatic hydroxylation of substituted benzenes, such as ethyl-, propyl-, or butylbenzene. This was remarkable, as other UPOs, such as PaDa I, never were described to form aromatic hydroxylated products of substituted benzenes beside for the hydroxylation of benzene and toluene. For example, the hydroxylation of ρ cymene by AbrUPO resulted in over 60% of aromatic hydroxylated products, with the 1,4-diol as main product. In a first catalytic step the phenol was formed, most likely due to a ‘NIH shift’ at the ortho position. In a second catalytic step, a second hydroxy group was introduced at para-position related to the firstly introduced OH-group, yielding 1,4-hydroquinones. Subsequently, a comparative analysis was conducted between AbrUPO and PaDa-I, exploring their capacity to catalyze the hydroxylation of phenols to 1,4-hydroquinones. For this purpose, a set of mono , di , and trisubstituted phenol derivatives was tested. In summary, the results of this study demonstrate that AbrUPO exhibited higher substrate acceptance and superior chemoselectivity for the formation of the targets 1,4-hydroquinones in comparison to PaDa-I. After the screening, preparative-scale reactions were conducted. A selection of substrates, including 2,3,6-trimethylphenol, 2-methylphenol, 2-ethylphenol, and thymol, were examined in 12.5-mL reactions at a substrate concentration of 10 mM. At this scale, AbrUPO catalyzed the transformation with moderate to high isolated yields (34–91%) and high product selectivity (~95%) for the 1,4-hydroquinones. Of particular importance is the hydroxylation of 2,3,6-trimethylphenol to the corresponding 1,4-hydroquinone, as the product serves as an intermediate in the synthesis of vitamin E. This reaction underlines that the resulting phenols and 1,4-hydroquinones of aromatically hydroxylated substituted benzenes are of particular interest for synthetic chemistry, as these are key building blocks in the synthesis of pharmaceuticals, dyes or agrochemicals. Therefore, AbrUPO (and other enzymes with the ability of this catalytic function) could be a promising alternative to classical chemical methods. For this reason, it was evident to gain a deeper understanding of the function of different amino acid residues in the active site of AbrUPO. A comparison of the active sites of AbrUPO with other described UPOs (PaDa-I, HspUPO and CglUPO) revealed major differences between in the positioning and amount of phenylalanine residues in the heme access channel and in the active site. With a single phenylalanine residue (F179) in the active site, AbrUPO exhibits the minimal presence of phenylalanine residues in the proximity of the heme, a characteristic that distinguishes it from other UPOs that have been analyzed. In comparison, PaDa-I has a “phenylalanine triad” (F69, F76 and F199) in close proximity to the heme, which may restrict aromatic hydroxylation of substituted benzenes, due to strong π- π stacking and geometric hindrances. Homologous positions in AbrUPOs active site are occupied by L80 and A186. Another major difference is that AbrUPO features a polar glutamic acid residue at position 87 (E87), whereas HspUPO and CglUPO have a phenylalanine at the homologous position (HspUPO; F176 and CglUPO; F171). Analysis of the heme access channel revealed another difference in the amount of phenylalanine residues. While AbrUPO has a phenylalanine residue at position F228, HspUPO contains a threonine (T225) and CglUPO a leucine residue (L220). A leucine residue (L231) at the opposite site of F228 could further restrict the heme access channel for bulkier substrates. Reasonably, positions L80, E87, F179, A186, F228, and L231 were addressed for site-directed mutagenesis, resulting in 22 single, double, triple and one quadruple mutants. The introduction of phenylalanine residues at positions L80F, E87F, and A186F of AbrUPO should mimic the active sites of CglUPO, HspUPO, and PaDa-I. In addition, double mutant L80F_A186F aimed at replicating the “phenylalanine triad” of PaDa-I. Furthermore, position A186 was examined in more detail with the introduction of smaller, less hydrophobic amino acids by creating the A186G and A186L variants. To analyze the role of the conserved phenylalanine residue at position F179, this phenylalanine residue was replaced with either alanine (F179A) or leucine (F179L). In pursuit to widen the heme access channel mutants F228L and L231 were created. The integration of UPO-expression cassettes into the genome of Pichia pastoris results in recombinant P. pastoris transformants with varying UPO gene copy numbers, leading to different expression levels. The identification of the strains showing the highest UPO expression level can be a time-consuming work for a large mutant library with the commonly used screening method. The conventional method involves pre-cultivation, a 72-hour expression phase, and a subsequent screening in 96-well plates using 2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS) as a substrate. This method requires up to five days. To optimize this process in terms of time needed, a straightforward two-step agar plate-based assay was developed to screen P. pastoris transformants for UPO activity with greater efficiency and reduced workload. This optimized assay is initiated with the cultivation and protein expression of the yeast on agar plates that have been supplemented with methanol and ABTS. Subsequently, a top agar layer containing ABTS and a peroxide (either cumene hydroperoxide or hydrogen peroxide) is added. Within just 15 minutes, UPO activity can be visually detected as green coloration zones surrounding UPO-secreting yeast cells. This method was validated using the two UPOs AbrUPO and PaDa-I. Practically, this assay could demonstrate that all tested UPO variants, beside mutant F228L_L231A, could be expressed and secreted as active enzymes. The first notable effect of the mutations was their impact on the peroxygenase and peroxidase activity (P:p ratio). It is noteworthy that variant L231A exhibited a 16-fold increase in the P:p ratio compared to the wild-type AbrUPO. This observation suggests that the L231A mutation, which widens the heme access channel, may enhance the accessibility of the substrate 5-nitro-1,3-benzodioxole (NBD) to the heme while simultaneously reducing peroxidase activity. But the most drastic difference was observed with variants including mutation A186F. These variants were not able to catalyze the aromatic hydroxylation of ethyl , propyl- and butylbenzene and cumene. Further, these variants were not able to catalyze reactions with ρ-cymene. In order to investigate the role of position 186 in determining the chemoselectivity of AbrUPO during the oxidation of substituted benzenes, a molecular docking analysis was performed using ethylbenzene as a model substrate. In the wild-type enzyme, the substrate could adopt multiple orientations within the active site, thereby facilitating both aromatic and aliphatic hydroxylation. In contrast, the A186F variant introduced significant steric hindrance, thereby reducing the size of the active site. As a result, ethylbenzene could only adopt a single binding orientation, leading exclusively to benzylic hydroxylation. Furthermore, π-π stacking interactions between the aromatic rings of ethylbenzene and the introduced phenylalanine residue A186F together with F179 are predicted to restrict substrate mobility. In summary, these findings underscore the critical role of residue A186 in governing the chemoselectivity of AbrUPO. The comprehensive substrate screenings and research on AbrUPO underlined a key limitation of the dual catalytic mechanism of UPOs. While the P450-like monooxygenase activity (responsible for the insertion of a single oxygen atom) frequently yielded the desired hydroxylated products, such as phenols or hydroquinones, the accompanying peroxidase activity, which involves hydrogen atom abstraction, frequently led to undesired overoxidation products, including quinones, ketones, and polymerization products. For this reason, different radical scavengers were tested, with ascorbic acid showing the best inhibition of peroxidase activity. Nevertheless, the possibility of overoxidation via alternative pathways could not be entirely excluded. Specifically, during benzylic hydroxylation reactions, the formation of ketones appeared to occur through gem-diol intermediates. Such pathways have been thoroughly documented in the context of cytochrome P450 systems.Im Jahr 2004 beschrieb die Forschungsgruppe unter der Leitung von Martin Hofrichter erstmals eine neue Gruppe von Oxidoreduktasen aus Pilzen, gefunden im Basidiomycet Agrocybe aegerita. Diese wurde später als unspezifische Peroxygenasen (UPOs) neu klassifiziert. UPOs enthalten ein Häm als prosthetische Gruppe und können Wasserstoffperoxid als Elektronenakzeptor und Sauerstoffdonor nutzen, um eine Vielzahl von aliphatischen oder aromatischen Substraten zu oxyfunktionalisieren. Dabei zeigen UPOs einen einzigartigen dualen katalytischen Reaktionsmechanismus, der den Reaktionszyklus klassischer Peroxidasen mit dem Peroxid-„Shunt“-Stoffwechselweg von Cytochrom-P450-Monooxygenasen (P450s) kombiniert. Während sowohl UPOs als auch P450s in der Lage sind, selektive Sauerstoffübertragung auf organische Substrate zu katalysieren, sind UPOs nicht auf teure Redoxpartner wie Nicotinamidadenindinukleotide (NAD(P)H) angewiesen. Dieser Vorteil macht UPOs zu einem interessanten Kandidaten für die Erweiterung der „biocatalytic toolbox”. Trotz des offensichtlichen Potenzials UPOs als Katalysatoren für Oxyfunktionalisierungs-reaktionen, befindet sich die Forschung zu dieser Enzymklasse noch in einem frühen Stadium. Eine große Herausforderung für den Fortschritt in diesem Bereich ist die Komplexität der heterologen Expression in rekombinanten Wirten. Bislang wurden nur etwas mehr als 50 (von über 4500 mutmaßlichen) UPOs heterolog exprimiert und beschrieben, womit sie deutlich hinter den gut charakterisierten P450s zurückliegen. Die Forschungsbemühungen konzentrierten sich bisher vor allem auf die Identifizierung und Charakterisierung neuer UPOs und ihrer nativen Substratbereiche. Im Gegensatz dazu sind die Ansätze im Bereich des Protein Engineering nach wie vor begrenzt, da nur wenige Studien die Modifikation von UPOs untersuchen. Folglich befindet sich das Verständnis darüber, wie Aminosäurereste innerhalb des aktiven Zentrums oder des Häm-Zugangskanals die Stereo- und Chemoselektivität beeinflussen, noch in einem frühen Stadium. Darüber hinaus gibt es nur wenige Beispiele für die Skalierung von UPO-katalysierten Reaktionen auf industrielles Maß. Um diese Herausforderungen anzugehen, begann diese Arbeit mit der Suche und Identifizierung neuer mutmaßlicher UPO-Gene. Auf der Grundlage einer umfassenden BLAST-Datenbanksuche wurden sieben mutmaßliche UPO-Gene ausgewählt und unter der Kontrolle des Methanol-induzierbaren AOX1p-Promotors in der rekombinanten Hefe Pichia pastoris, zuletzt neu klassifiziert als Komagataella phaffii, exprimiert. Unter diesen sieben mutmaßlichen UPO-Genen war die AbrUPO aus Aspergillus brasiliensis die Einzige, die eine relativ hohe volumetrische Aktivität von 93,0 U l-1 gegenüber 2,2′-Azino-di(3-ethyl-benzthiazolin-6-sulfonsäure) (ABTS) aufwies. Anschließend wurde die AbrUPO für eine Fed-Batch-Kultivierung in einem 7,5-l-Bioreaktor ausgewählt. Dort wurde die AbrUPO mit einer Ausbeute von ~750 mg l-1 aktivem Enzym produziert, was die bisher höchste Ausbeute einer Wildtyp-UPO darstellt. Das gereinigte Enzym zeigte eine vergleichbare pH- und thermische Stabilität wie andere beschriebene UPOs, beispielsweise die weiterentwickelte PaDa-I-Variante der AaeUPO aus Agrocybe aegerita. Dennoch zeigte die AbrUPO im Vergleich zur PaDa-I eine geringere Stabilität in organischen Lösungsmitteln. Nach dieser biochemischen Charakterisierung wurden die katalytischen Möglichkeiten der AbrUPO gegenüber verschiedenen Substraten getestet, darunter substituierte Benzole und Phenole, Sulfide, Terpene, Terpenoide und Fettsäuren. Bei diesem Substrat-Screening zeigte sich, dass die AbrUPO im Gegensatz zu anderen UPOs in der Lage war, die aromatische Hydroxylierung von substituierten Benzolen wie Ethyl-, Propyl- oder Butylbenzol zu katalysieren. Dies war bemerkenswert, da andere UPOs, wie PaDa I, neben der Hydroxylierung von Benzol und Toluol nie beschrieben wurden, aromatische hydroxylierte Produkte von substituierten Benzolen zu bilden. Beispielsweise führte die Hydroxylierung von ρ-Cymene durch die AbrUPO zu über 60 % aromatischen hydroxylierten Produkten, wobei das 1,4 Diol das Hauptprodukt war. In einem ersten katalytischen Schritt wurde das Phenol gebildet, höchstwahrscheinlich aufgrund einer „NIH-shift” an der ortho-Position. In einem zweiten katalytischen Schritt wurde eine zweite Hydroxygruppe an der para-Position in Bezug auf die zuerst eingeführte OH-Gruppe eingeführt, wodurch 1,4-Hydroquinone entstand. Anschließend wurde eine vergleichende Analyse zwischen der AbrUPO und PaDa-I durchgeführt, um ihre Fähigkeit zur Katalyse der Hydroxylierung von Phenolen zu 1,4-Hydrochinonen zu untersuchen. Zu diesem Zweck wurde eine Reihe von mono-, di- und trisubstituierten Phenolderivaten getestet. Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse dieser Studie, dass die AbrUPO im Vergleich zu PaDa-I eine höhere Substratakzeptanz und eine überlegene Chemoselektivität für die Bildung der 1,4-Hydrochinone aufweist. Nach dem Screening wurden Reaktionen im präparativen Maßstab durchgeführt. Eine Auswahl von Substraten, darunter 2,3,6-Trimethylphenol, 2-Methylphenol, 2 Ethylphenol und Thymol, wurde in 12,5-ml-Reaktionen bei einer Substratkonzentration von 10 mM untersucht. In diesem Maßstab katalysierte die AbrUPO die Umwandlung mit mäßigen bis hohen isolierten Ausbeuten (34–91 %) und einer hohen Produktselektivität (~95 %) für die 1,4-Hydrochinone. Von besonderer Bedeutung ist die Hydroxylierung von 2,3,6-Trimethylphenol zum entsprechenden 1,4-Hydrochinon, da das Produkt als Zwischenprodukt bei der Synthese von Vitamin E dient. Diese Reaktion unterstreicht, dass die resultierenden Phenole und 1,4-Hydrochinone von aromatisch hydroxylierten substituierten Benzolen für die synthetische Chemie von besonderem Interesse sind, da sie wichtige Bausteine für die Synthese von Arzneimitteln, Farbstoffen oder Agrochemikalien sind. Daher könnte die AbrUPO (und andere Enzyme mit dieser katalytischen Funktion) eine vielversprechende Alternative zu klassischen chemischen Methoden darstellen. Aus diesem Grund war es naheliegend, ein tieferes Verständnis für die Funktion verschiedener Aminosäurereste im aktiven Zentrum der AbrUPO zu erlangen. Ein Vergleich der aktiven Zentren von der AbrUPO mit anderen beschriebenen UPOs (PaDa-I, HspUPO und CglUPO) ergab Unterschiede in der Positionierung und Menge der Phenylalanin Reste im Häm-Zugangskanal und im aktiven Zentrum, was auf wesentliche Unterschiede zwischen diesen UPOs hindeutete. Mit einem einzigen Phenylalanin Rest (F179) im aktiven Zentrum weist die AbrUPO die geringste Präsenz von Phenylalanin Resten in der Nähe des Häms auf, eine Eigenschaft, die es von anderen analysierten UPOs unterscheidet. Im Vergleich dazu weist die PaDa-I eine „Phenylalanin-Dreieck“ (F69, F76 und F199) in unmittelbarer Nähe zum Häm auf, was aufgrund starker π-π-Stapelung und geometrischer Hindernisse die aromatische Hydroxylierung von substituierten Benzolen einschränken könnte. Homologe Positionen im aktiven Zentrum der AbrUPO werden von L80 und A186 eingenommen. Ein weiterer wichtiger Unterschied besteht darin, dass die AbrUPO einen polaren Glutaminsäure Rest an Position 87 (E87) aufweist, während die HspUPO und CglUPO an der homologen Position ein Phenylalanin haben (HspUPO; F176 und CglUPO; F171). Die Analyse des Häm-Zugangskanals ergab einen weiteren Unterschied in der Menge der Phenylalanin Reste. Während die AbrUPO einen Phenylalanin Rest an Position F228 aufweist, enthält die HspUPO ein Threonin (T225) und die CglUPO einen Leucin Rest (L220). Ein Leucin Rest (L231) an der gegenüberliegenden Stelle von F228 könnte den Häm-Zugangskanal für größere Substrate weiter einschränken. Daher wurden die Positionen L80, E87, F179, A186, F228 und L231 für eine Mutagenese ausgewählt, was zu 22 Einzel-, Doppel-, Dreifach- und einer Vierfachmutante führte. Die Einführung von Phenylalanin Resten an den Positionen L80F, E87F und A186F der AbrUPO soll die aktiven Stellen der CglUPO, HspUPO und der PaDa-I nachahmen. Darüber hinaus repliziert die Doppelmutante L80F_A186F das „Phenylalanin-Dreieck“ der PaDa-I. Darüber hinaus wurde die Position A186 durch die Einführung kleinerer, weniger hydrophober Aminosäuren unter Schaffung der Varianten A186G und A186L genauer untersucht. Um die Rolle des konservierten Phenylalanin Rests an Position F179 zu analysieren, wurde dieser Phenylalanin Rest entweder durch Alanin (F179A) oder Leucin (F179L) ersetzt. Um den Zugangskanal zum Häm zu erweitern, wurden schließlich die Mutanten F228L und L231 erzeugt. Die Integration von UPO-Expressionskassetten in das Genom von P. pastoris führt zu rekombinanten P. pastoris-Transformanten mit unterschiedlichen UPO-Genkopienzahlen, was zu unterschiedlichen Expressionsleveln führen kann. Die Bestimmung der Stämme mit dem höchsten UPO-Expressionslevel kann bei einer so großen Mutantenbibliothek mit der üblicherweise verwendeten Screening-Methode sehr zeitaufwendig sein. Die herkömmliche Methode umfasst eine Vorkultur, eine 72-stündige Expressionsphase und ein anschließendes Screening in 96-Well-Platten unter Verwendung von 2,2′-Azino-bis(3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonsäure) (ABTS) als Substrat. Diese Methode dauert bis zu fünf Tage. Um diesen Prozess zu optimieren, wurde ein einfacher zweistufiger Agarplatten-basierter Assay entwickelt, um P. pastoris-Transformanten mit höherer Effizienz und geringerem Arbeitsaufwand auf UPO-Aktivität zu screenen. Der Test beginnt mit der Kultivierung und Proteinexpression des Organismus auf Agarplatten, die mit Methanol und 2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonsäure) (ABTS) supplementiert wurden. Anschließend wird eine top-layer Agerschicht mit ABTS und einem Peroxid (entweder Cumolhydroperoxid oder Wasserstoffperoxid) hinzugefügt. Innerhalb von nur 15 Minuten kann die UPO-Aktivität visuell als grüne Färbung um die UPO-sekretierenden Kolonien herum nachgewiesen werden. Diese Methode wurde mit den beiden UPOs AbrUPO und PaDa-I validiert. In der Praxis konnte dieser Assay zeigen, dass alle getesteten UPO-Varianten, mit Ausnahme der Mutante F228L_L231A, als aktive Enzyme exprimiert und sekretiert werden konnten. Die erste bemerkenswerte Auswirkung der Mutationen war ihr Einfluss auf die Peroxygenase- und Peroxidaseaktivität (P:p-ratio). Bemerkenswert ist, dass die Variante L231A im Vergleich zum Wildtyp einen 16-fachen Anstieg der P:p-ratio aufwies. Diese Beobachtung legt nahe, dass die L231A-Mutation, die den Zugangskanal zum Häm erweitert, die Zugänglichkeit von 5-Nitro-1,3-benzodioxol (NBD) zum Häm verbessern und gleichzeitig die Peroxidaseaktivität verringern könnte. Der drastischste Unterschied wurde jedoch bei Varianten mit der Mutation A186F beobachtet. Diese Varianten waren nicht in der Lage, die aromatische Hydroxylierung von Ethyl-, Propyl- und Butylbenzol sowie Cumol zu katalysieren. Darüber hinaus waren diese Varianten nicht in der Lage, Reaktionen mit ρ Cymene zu katalysieren. Um die Rolle der Position 186 bei der Bestimmung der Chemoselektivität der AbrUPO während der Oxidation von substituierten Benzolen zu untersuchen, wurde eine molecular docking-Analyse unter Verwendung von Ethylbenzene als Modellsubstrat durchgeführt. Im Wildtyp-Enzym konnte das Substrat mehrere Ausrichtungen innerhalb des aktiven Zentrums einnehmen, wodurch sowohl die aromatische als auch die aliphatische Hydroxylierung ermöglicht wurden. Im Gegensatz dazu führte die A186F-Variante zu einer erheblichen sterischen Hinderung, wodurch die Größe des aktiven Zentrums verringert wurde. Infolgedessen konnte Ethylbenzol nur eine einzige Bindungsorientierung einnehmen, was ausschließlich zu benzylischer Hydroxylierung führte. Darüber hinaus wird angenommen, dass π π stacking zwischen den aromatischen Ringen von Ethylbenzol und dem eingeführten Phenylalanin Rest A186F zusammen mit F179 die Substratmobilität einschränken. Zusammenfassend unterstreichen diese Ergebnisse die entscheidende Rolle des Restes A186 bei der Chemoselektivität der AbrUPO. Die umfassenden Substratscreenings und Forschungen an der AbrUPO haben eine wesentliche Einschränkung des dualen katalytischen Mechanismus von UPOs aufgezeigt. Während die P450-ähnliche Monooxygenase-Aktivität (verantwortlich für die Einfügung eines einzelnen Sauerstoffatoms) häufig die gewünschten hydroxylierten Produkte wie Phenole oder Hydroquinone lieferte, führte die Peroxidase-Aktivität häufig zu unerwünschten Oxidationsprodukten wie Quinone, Ketone und Polymerisationsprodukten. Aus diesem Grund wurden verschiedene „Radikalfänger“ getestet, wobei Ascorbinsäure die beste Hemmung der Peroxidaseaktivität zeigte. Dennoch konnte die Möglichkeit einer Überoxidation über alternative Wege nicht vollständig ausgeschlossen werden. Insbesondere während benzylischer Hydroxylierungsreaktionen schien die Bildung von Ketonen über gem-Diol-Zwischenprodukte zu erfolgen. Solche Wege sind im Zusammenhang mit Cytochrom-P450-Systemen ausführlich dokumentiert. | |||||||
| Lizenz: |  Dieses Werk ist lizenziert unter einer Creative Commons Namensnennung 4.0 International Lizenz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Chemie » Biochemie | |||||||
| Dokument erstellt am: | 14.09.2026 | |||||||
| Dateien geändert am: | 14.09.2026 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 09.09.2025 | |||||||
| Datum der Promotion: | 15.12.2025 |
