Dokument: Characterization of Amyloidogenic Proteins using NMR Spectroscopy

Titel:	Characterization of Amyloidogenic Proteins using NMR Spectroscopy
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=73989
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20260803-081437-4
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Gardon, Luis [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 68,55 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 20.07.2026 / geändert 20.07.2026
Beitragende:	Heise, Henrike [Gutachter] Dr. Lakomek, Nils-Alexander [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Diese Arbeit konzentriert sich auf die Verwendung der Kernspinresonanzspektroskopie (NMR) zur Untersuchung amyloidogener Systeme und zur Erforschung der molekularen Übergänge von monomeren Proteinen zu aggregierten Fibrillen. Die Amyloidbildung steht im Zusammenhang mit zahlreichen neurodegenerativen Erkrankungen, doch viele mechanistische Aspekte, wie beispielsweise der Einfluss der Aggregationsbedingungen, sind noch weitgehend unerforscht. Die NMR bietet einzigartige Einblicke auf atomarer Ebene sowohl in die Struktur als auch in die Dynamik und ist damit ein leistungsfähiges und vielseitiges Werkzeug zur Untersuchung dieser Fragen. Diese Arbeit unterstreicht die breite Anwendbarkeit verschiedener NMR-Techniken zur Untersuchung von Aggregationsprozessen und Strukturzuständen in amyloidogenen Systemen. Um zu untersuchen, wie Lösungsbedingungen und Sequenzmodifikationen die Fibrillenstruktur beeinflussen, haben wir uns auf zwei verwandte Systeme konzentriert: LS-förmige Amyloid-β (Aβ) (1-42) Fibrillen und pyroglutamylierte (pE) Aβ(3-42) Fibrillen. In der ersten Studie haben wir gezeigt, dass LS-förmige Aβ(1-42) Fibrillen über einen weiten pH-Bereich (pH 2-7) robust sind. Festkörper-NMR zeigte, dass der β-Faltblattkern und der rigide N-Terminus konserviert bleiben, während am C-Terminus pH-abhängige Veränderungen auftreten. Insbesondere beobachteten wir eine Umordnung der K28-D1-Salzbrücke bei niedrigem pH-Wert zu einer K28-A42-Wechselwirkung bei neutralem pH-Wert, was mit Molekulardynamik-Simulationen (MD) übereinstimmt. In einer zweiten Studie haben wir Fibrillen charakterisiert, die aus pEAβ(3-42) gebildet wurden, das einen N-terminalen Pyroglutamatrest an Position 3 trägt. Diese pEAβ(3-42) Fibrillen wurden unter den gleichen Bedingungen wie die LS-förmigen Aβ(1-42) Fibrillen hergestellt und zeigten, dass die Faltung weitgehend konserviert ist, einschließlich der β-Faltblattbereiche und des zentralen Turn-Bereichs um V24. Das Fehlen von D1 eliminiert jedoch die K28–D1-Salzbrücke und die Analyse der chemischen Verschiebungen deuten auf eine mögliche Umordnung zu einer K28–A42-Wechselwirkung hin. Interessanterweise zeigten die Glycinreste G37 und G38, die aufgrund des abgeschnittenen N-Terminus exponiert sind, signifikante Änderungen der chemischen Verschiebungen und fungieren als Reporter dieser Konformationsänderung.Um tiefere Einblicke in den Mechanismus der Amyloidfibrillenbildung zu gewinnen, untersuchten wir in einer dritten Studie die PI3K-SH3-Domäne, ein etabliertes Modellsystem für Faltung und Fibrillierung, unter Verwendung einer Kombination aus Lösungs- und Festkörper-NMR-Spektroskopie. Wir verfolgten die geseedete Aggregation von PI3K-SH3, indem wir Experimente auf Basis von INEPT (Insensitive Nuclei Enhanced by Polarization Transfer) und CP (Cross-Polarization) durchführten, um die Umwandlung von Monomeren zu Fibrillen zu verfolgen. Bemerkenswert ist, dass trotz der unterschiedlichen Agitationsgrade der verschiedenen Techniken die beobachtete Aggregationskinetik unter geseedeten Bedingungen konsistent war, was darauf hindeutet, dass Fibrillen-Elongation der primäre Wachstumsmechanismus ist und nicht die Bildung von Nuclei. In einer vierten Studie verwendeten wir dynamic nuclear polarization (DNP) verstärkte NMR-Spektroskopie, um das Konformationsverhalten selektiv markierter Isoleucinreste in gefalteten, entfalteten und fibrillären Zuständen verschiedener Proteine zu untersuchen. Diese Experimente zeigten, dass Isoleucin-Seitenkettenreste als Indikatoren für Konformationszustände in wenig populierten oder flexiblen Bereichen dienen können, und unterstreichen das Potenzial von DNP für breitere Anwendungen auf andere Aminosäureseitenketten biomolekularer Systeme. Wir verwendeten außerdem die paramagnetische Relaxationsverstärkung (PRE) mit Dotarem, um die Oberflächenzugänglichkeit in nativen, fibrillären und ungefalteten Formen von PI3K-SH3 zu untersuchen. Dieser Ansatz bot eine einfache, aber effektive Möglichkeit, die Lösungsmittelexposition über Konformationszustände hinweg abzubilden. Diese Arbeit umfasst auch die Charakterisierung von PI3K-SH3 in seiner nativen gefalteten Form bei neutralem pH-Wert, einer sauren Umgebung mit niedrigem pH-Wert, die ein pH-abhängiges Faltungsverhalten zeigt, und seinem fibrillären Zustand. Mithilfe von Festkörper-NMR und Rasterkraftmikroskopie (AFM) haben wir den fibrillären Polymorphismus verglichen und unterstützende Protokolle und methodische Details bereitgestellt, darunter eine benutzerdefinierte Pulssequenz. Insgesamt zeigt diese Arbeit, wie eine Kombination fortschrittlicher NMR-Methoden eingesetzt werden kann, um die Struktur, Dynamik und Aggregationskinetik von amyloidogenen Proteinen zu charakterisieren. Die hier angewandten Strategien sind auf eine Vielzahl von Systemen anwendbar und tragen zu einem tieferen molekularen Verständnis der Amyloidbildung bei. This thesis focusses on the use of nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy to study amyloidogenic systems and to explore the molecular transitions from monomeric proteins to aggregated fibrils. Amyloid formation is associated with numerous neurodegenerative diseases, yet many mechanistic aspects, such as the influence of aggregation conditions, remain poorly understood. NMR provides unique atomic-level insights into both structure and dynamics, making it a powerful and versatile tool for investigating these questions. This work highlights the broad applicability of different NMR techniques for studying aggregation processes and structural states across amyloidogenic systems. To investigate how solution conditions and sequence modifications influence fibril structure, we focused on two related systems: LS-shaped Amyloid-β (Aβ) (1-42) fibrils and pyroglutamylated (pE) Aβ(3-42) fibrils. In the first study, we demonstrated that LS-shaped Aβ(1-42) fibrils were robust across a wide range of pH values (pH 2-7). Solid-state NMR revealed that the β-sheet core and rigid N-terminus remain conserved, with pH-dependent changes at the C-terminus. Specifically, we observed a rearrangement of the K28-D1 salt bridge at low pH into K28-A42 interaction at neutral pH in line with molecular dynamics (MD) simulations. In a second study, we characterized fibrils formed by pEAβ(3-42) carrying an N-terminal pyroglutamate residue at position 3. These pEAβ(3-42) fibrils were grown under the same conditions as the LS-shaped Aβ(1-42) fibrils and showed a largely preserved overall fold, including β-sheet regions and the central turn region around V24. However, the loss of D1 eliminates the K28–D1 salt bridge and chemical shift data suggest a possible rearrangement to a K28–A42 interaction. Interestingly, glycine residues G37 and G38, which are exposed due to the truncated N-terminus, showed significant chemical shift changes and act as reporters of this conformational adaptation. To gain deeper insight into the mechanism of amyloid fibril formation, we investigated the PI3K-SH3 domain, a well-established model system for folding and fibrillation, using a combination of solution-state and solid-state NMR spectroscopy in a third study. We followed the seeded aggregation of PI3K-SH3 by recording insensitive nuclei enhanced by polarization transfer (INEPT)- and cross-polarization (CP)-based experiments following the conversion from monomers to fibrils. Notably, despite the differing degrees of agitation across the techniques, the observed aggregation kinetics under seeded conditions were consistent, pointing to fibril elongation as the primary mechanism of growth rather than nucleation. In a fourth study we employed dynamic nuclear polarization (DNP)-enhanced NMR spectroscopy to probe the conformational behavior of selectively labeled isoleucine residues in folded, unfolded and fibrillar states of various proteins. These experiments demonstrated that isoleucine side chain residues can be reporters of conformation states for low populated or flexible regions and highlight the potential of DNP for broader applications to other amino acid side chains of biomolecular systems. We further employed solvent paramagnetic relaxation enhancement (PRE) using Dotarem to assess surface accessibility in native, fibrillar, and unfolded forms of PI3K-SH3. This approach provided a simple yet effective way to map solvent exposure across conformational states. This thesis also includes the characterization of PI3K-SH3 in its native folded form at neutral pH, an acidic low-pH condition revealing pH-dependent folding behavior, and its fibrillar state. Using solid-state NMR and atomic force microscopy (AFM), we compared fibrillar polymorphism and provide supporting protocols and methodological details, including a custom pulse sequence. Altogether, this work demonstrates how a combination of advanced NMR methods can be employed to characterize structure, dynamics, and aggregation kinetics of amyloidogenic proteins. The strategies employed here are applicable to a broad range of systems and contribute to a deeper molecular understanding of amyloid formation.
Lizenz:	Dieses Werk ist lizenziert unter einer Creative Commons Namensnennung 4.0 International Lizenz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Physikalische Biologie
Dokument erstellt am:	03.08.2026
Dateien geändert am:	03.08.2026
Promotionsantrag am:	19.11.2025
Datum der Promotion:	28.05.2026