Dokument: Titinmodifikationen durch simulierte Ischämie und Reperfusion in adulten Rattenkardiomyozyten

Titel:	Titinmodifikationen durch simulierte Ischämie und Reperfusion in adulten Rattenkardiomyozyten
Weiterer Titel:	Titin modifications induced by simulated ischemia and reperfusion in adult rat cardiomyocytes
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=73967
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20260723-133203-9
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Köster, Johanna [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 4,94 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 16.07.2026 / geändert 16.07.2026
Beitragende:	Prof. Dr. rer. nat. Krüger, Martina [Gutachter] Prof. Dr. med. Schmitt, Joachim [Gutachter]
Stichwörter:	Titin
Dewey Dezimal-Klassifikation:	600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften » 610 Medizin und Gesundheit
Beschreibungen:	Kardiovaskuläre Erkrankungen, insbesondere die koronare Herzkrankheit, zählen weiterhin zu den führenden Todesursachen weltweit. Der akute Myokardinfarkt stellt dabei aufgrund der damit verbundenen Morbidität und Mortalität eine der schwerwiegendsten Manifestationen dar. Ein detailliertes Verständnis der mit Ischämie und Reperfusion (I/R) einhergehenden pathophysiologischen Zusammenhänge ist entscheidend, um therapeutische Strategien weiter zu optimieren. Das zentrale sarkomerische Protein Titin übernimmt in Kardiomyozyten zahlreiche strukturelle, mechanische und regulatorische Aufgaben. Veränderungen und Modifikationen von Titin während eines Myokardinfarkts können daher entscheidende Ansatzpunkte für zukünftige therapeutische Strategien sein. Aus diesem Grund wurde in dieser Arbeit das Ziel verfolgt, ein funktionsfähiges und vielseitiges in-vitro-I/R-Modell zu entwickeln, mit dem Titin und potenzielle Modifikationen untersucht werden können. Im Rahmen des Forschungsprojekts wurde ein zellkulturelles I/R-Modell mit adulten Rattenkardiomyozyten etabliert. Die zentralen Elemente der Simulation waren eine mit sauerstoffarmem Mischgas gefüllte Hypoxiekammer sowie spezifisch auf die Stoffwechselsituation angepasste Pufferlösungen. Relevante Parameter konnten dabei zielgenau eingestellt und nach Bedarf variiert werden. Im Rahmen des Etablierungsprozesses wurden bereits erste Untersuchungen von Titinmodifikationen und zugehörigen Prozessen durchgeführt. Zu den Untersuchungen zählte die Analyse von posttranslationalen Titinphosphorylierungen der PEVK-Region, die Einfluss auf die passive Steifigkeit der Kardiomyozyten haben. Darüber hinaus wurde die Titinubiquitinierung untersucht, die bei der Proteinqualitätskontrolle eine Rolle spielt. Vorherige Studien im Mausmodell mit kardialer I/R konnten eine PKCα-vermittelte Hyperphosphorylierungen der PEVK-Region von Titin an den Stellen S11878 und S12022 beschreiben, die mit einer Steigerung der passiven Steifigkeit der Kardiomyozyten einherging. Es wird angenommen, dass diese Veränderungen in der Frühphase des Infarkts zur Stabilisierung beitragen, bis ausreichend Narbengewebe gebildet werden konnte. In der vorliegenden Arbeit wurden diese Titinmodifikationen in unterschiedlichen I/R-Simulationsmodellen mit variierenden Ischämiedauern von 45 Minuten, 120 Minuten und 16 Stunden sowie jeweils anschließenden Reperfusionssimulationen untersucht. Die Hyperphosphorylierung der PEVK-Region mit einhergehender Aktivitätssteigerung von PKCα konnte dabei nicht reproduziert werden. Dies lässt den Schluss zu, dass Hypoxie und Teilkomponenten der Ischämie nicht die entscheidenden Reize für diese Titinmodifikationen sind und eine Beteiligung weiterer Einflussfaktoren wahrscheinlich ist. Um diese zu identifizieren, sind in Zukunft weitere Untersuchungen mit dem I/R-Modell notwendig. Die Proteinqualitätskontrolle spielt in Kardiomyozyten eine bedeutende Rolle für die Sicherstellung der Funktionsfähigkeit der Zellen. Auch unter Stressbedingungen können bestimmte Abbausysteme wie das autophagosomal-lysosomale System zum Überleben der Zellen beitragen. Titin stellt aufgrund seiner enormen Größe eine Herausforderung für die Proteinqualitätskontrolle und den Abbau dar. Die Prozesse des Titinabbaus, insbesondere unter Infarktbedingungen, sind bisher noch nicht vollständig verstanden. Untersuchungen in einem in-vivo-Mausmodell konnten bereits zeigen, dass es in den ersten Tagen nach einem Infarkt zu einem gesteigerten Titinabbau, einhergehend mit einer gesteigerten proteasomalen Aktivität kam. Um weitere Erkenntnisse zum I/R-bedingten Titinabbau zu erlangen, erfolgte in dieser Arbeit die Analyse der Titindegradation im zellkulturellen I/R-Simulationsmodell. Da sich im Verlauf der Etablierung nach 16-stündiger Ischämie Veränderungen im Titinabbau andeuteten, erfolgte eine nähere Untersuchung der Prozesse mittels Western-Blot-Verfahren nach 16 Stunden Ischämie und nachfolgender 4-stündiger Reperfusion. Durch ergänzende Experimente mit dem Autophagieinhibitor Bafilomyocin A1 konnte gezeigt werden, dass unter ischämischen Bedingungen ein vermehrter Abbau von ubiquitiniertem Titin über das Autophagosom stattfindet. In diesem Zusammenhang konnte nachgewiesen werden, dass die hypoxische Komponente des ischämischen Reizes dafür von entscheidender Bedeutung ist. Dem gegenüber deuteten weitere Versuchsergebnisse darauf hin, dass Autophagie unter Basalbedingungen eine untergeordnete Rolle beim Abbau von Titin spielt. Die Analyse von autophagieassoziierten Proteinen nach Simulation von 16 Stunden Ischämie und 4 Stunden Reperfusion wiesen auf eine gesteigerte Autophagieaktivität hin. Die Messung der Aktivitätslevel bestimmter Autophagieregulatoren deutete jedoch insgesamt auf eine differenzierte Autophagieaktivität im Zeitverlauf der Ischämie hin. Um diese Abläufe und Mechanismen im Detail nachvollziehen zu können, bedarf es weiterer Messungen. Insgesamt konnten mit dem hier etablierten Modell erste Erkenntnisse zu zwei Gruppen von Titinmodifikationen unter I/R-Simulationsbedingungen gewonnen werden. Während im Organismus eine Vielzahl an Infarkt-assoziierten Faktoren parallel wirken und sich gegenseitig beeinflussen, gelingt durch das in-vitro-I/R-Simulationsmodell eine selektive Analyse spezifischer Mechanismen in ausgewählten Zellarten. Folglich stellt es eine wertvolle Ergänzung zu komplexen multifaktoriellen in-vivo-Modellen dar. Für die weitere Infarktforschung steht somit ein Modell bereit, welches vor allem in Kombination mit in-vivo-Experimenten und klinischen Daten relevante Erkenntnisse liefern kann. Cardiovascular diseases, especially coronary heart disease, remain among the leading causes of death worldwide. One of the most severe manifestations of this disease is the myocardial infarction due to its associated morbidity and mortality. A detailed understanding of the underlying pathophysiological mechanisms of ischemia and reperfusion (I/R) is crucial for optimising therapeutic strategies. In cardiomyocytes the central sarcomeric protein titin has numerous structural, mechanical and regulatory functions. Alterations and modifications of titin during ischemia and reperfusion may therefore be crucial starting points for future therapeutic approaches. For this reason, the aim of this study was to develop a functional and versatile in vitro I/R model to investigate titin and potential modifications. A main part of the research project was to establish a cell culture I/R model with adult rat cardiomyocytes. The central components of the simulation were a hypoxia chamber filled with a low-oxygen gas mixture and buffers adjusted to the specific metabolic situation. It was possible to set up relevant parameters precisely and modify them as needed. While establishing the I/R model, first investigations of titin modifications and associated processes have already been carried out. The analyses included posttranslational titin phosphorylation of the PEVK region, which influences the passive stiffness of cardiomyocytes. In addition, titin ubiquitination, which plays a role in protein quality control, was investigated. Previously, PKCα mediated hyerphosphorylation of the PEVK region at the sites S11878 and S12022, which was associated with an increase in passive stiffness, has been described in mouse models. It has been assumed that these changes contribute to ventricular stability in the early phase of infarction until sufficient scar tissue has been formed. In the current investigation, these titin modifications were examined in different I/R models with varying durations of ischemia of 45 minutes, 120 minutes and 16 hours, each followed by reperfusion simulations. The hyperphosphorylation of the PEVK region with increase in PKCα activity could not be reproduced. This leads to the conclusion that hypoxia and components of ischemia may not be the key stimuli for these titin modifications and that other factors are likely to be involved. To identify these factors, further investigations with the I/R model are required. Protein quality control plays an important role in ensuring the functionality of cardiomyocytes. Moreover, under stressful conditions, certain degradation systems, such as the autophagy, can contribute to cell survival. Due to its enormous size, titin is a challenge for protein quality control and degradation. The processes of titin degradation, particularly under myocardial infarction, are not yet fully understood. Studies in an in vivo mouse model have already shown that increased titin degradation, accompanied by increased proteasomal activity, occurs in the remote area of the heart in the first few days after a myocardial infarction. Here, in order to obtain further insights into I/R-induced titin degradation, it was analysed in cell cultural I/R simulation models. Since changes in titin degradation were observed during the development of the in vitro I/R model after 16 hours of ischaemia, the underlying mechanisms were investigated in more detail using western blot analysis after 16 hours of ischemia followed by 4 hours of reperfusion. Additional experiments with the autophagy inhibitor bafilomycin A1 showed that under ischaemic conditions there is an increased degradation of ubiquitinated titin via the autophagosome. In this context, it was demonstrated that the hypoxic component of the ischaemic stimulus is crucial for the increased autophagosomal-lysosomal degradation. At the same time, further results indicated that autophagy plays a minor role in degradation of titin under basal conditions. The analysis of autophagy-associated proteins after 16 hours of ischemia and after 4 hours of reperfusion may indicate an increase in autophagy activity. However, assessments of the activity of certain autophagy regulators suggested differentiated autophagy activity over the ischaemic period. Further measurements are required to understand these processes and mechanisms in detail. Overall, the established I/R simulation model has yielded initial insights into two different groups of titin modifications under I/R conditions. While a multitude of I/R-associated factors act simultaneously in the organism and interact with each other, the in vitro model makes a selective analysis of specific mechanisms possible. Therefore, it represents a valuable addition to complex multifactorial in vivo models. For further research on myocardial infarction the established model can provide important findings, especially when combined with in vivo experiments and clinical data.
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Fachbereich / Einrichtung:	Medizinische Fakultät » Institute » Institut für Herz- und Kreislaufphysiologie
Dokument erstellt am:	23.07.2026
Dateien geändert am:	23.07.2026
Promotionsantrag am:	09.02.2026
Datum der Promotion:	14.07.2026