Dokument: Indole C-methyltransferases – creating an efficient platform for the enantioselective methylation of bioactive compounds.

Titel:	Indole C-methyltransferases – creating an efficient platform for the enantioselective methylation of bioactive compounds.
Weiterer Titel:	Indol-C-Methyltransferasen – Schaffung einer effizienten Plattform für die enantioselektive Methylierung bioaktiver Verbindungen
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=72566
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20260325-164945-8
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Amariei, Diana-Alexandra [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 19,97 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 17.03.2026 / geändert 17.03.2026
Beitragende:	Prof. Dr. Pietruszka, Jörg [Betreuer/Doktorvater] Prof. Dr. Gohlke, Holger [Betreuer/Doktorvater]
Stichwörter:	Biocatalysis
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 540 Chemie
Beschreibungen:	The biosynthesis of the acetylcholinesterase (AChE) inhibitor physostigmine was described for the producing organism Streptomyces griseofuscus, and it was found to include a stereoselective methylation step catalyzed by the SAM-dependent methyltransferase PsmD, which determines the configuration of the final compound and triggers the formation of the specific pyrroloindole ring. Several PsmD product analogs have already demonstrated AChE inhibition, making the structural diversification of PsmD products an intriguing prospect, as it provides potential for identifying new drug candidates to treat related neurological disorders. A new PsmD-like indole C-methyltransferase was identified, originating from Streptomyces albulus (noursei) (PsmD_Sa). The enzyme was expressed and analyzed regarding structure, mechanism and biochemical properties. The biochemical analysis revealed a higher stability, compared to its previously characterized homolog from Streptomyces griseofuscus (PsmD_Sg), while maintaining the stereoselectivity of the methylation reaction. The crystal structure of PsmD_Sg was determined experimentally using X-ray spectroscopy in collaboration with Prof. Dr. Oliver Weiergräber (IBI-7: Structural biochemistry, Forschungszentrum Jülich) and used as a template for the precise in silico modeling of the PsmD_Sa structure. Site-directed mutagenesis was used to map the catalytic site and elucidate the mechanism of PsmD_Sa. The results were corroborated with molecular docking and molecular dynamic simulations performed by Dr. Benoit David (IBG-4: Bioinformatics, Forschungszentrum Jülich), offering an overview of the PsmD catalysis. A mobile N-terminal “lid” was identified, playing a crucial role in triggering the catalytic process after the binding of the substrate and the cofactor. A Glu-His-Tyr catalytic triad was found to activate the substrate through a proton shuttling action. The semi-rational engineering of PsmD_Sa led to the improvement of its activity towards bulky non-natural indole-containing substrates. Five positions in the catalytic site were targeted in a sequential manner through site saturation mutagenesis, producing focused mutant libraries. To generate and screen the resulting mutant libraries, the AutoBioTech integrated laboratory platform was utilized in collaboration with Dr. Julia Tenhaef (IBG-1: Biotechnology, Forschungszentrum Jülich). A modular approach was designed to automate the enzyme expression, enzymatic reactions and activity screening in 96-well microtiter plates. A new high-throughput colorimetric assay for indole detection was developed for the efficient screening of the resulting mutant libraries. The assay allows the detection of the PsmD substrate concentration in the presence of the isolated enzyme, as well as using whole-cell biocatalysts. The engineering and screening of the PsmD_Sa variants led to the identification of new mutants with significantly improved activity for the tested substrates, and the key position 166 was found to play an important role in the productive binding of bulky substrate derivatives. The site-directed mutagenesis of PsmD_Sa aimed to expand its alkylation capacity using an ethylated SAM cofactor derivative (SAE). Two enzymatic SAE supply systems were used in cascade with PsmD_Sa and the new mutants. The coupled PsmD_SAE supply systems were optimized, leading to a 7-fold improvement of PsmD-catalyzed conversion to the ethylated product using the wild-type enzyme. Two mutants, A125G and F126L performed better than the wild type in the reactions using several SAM cofactor derivatives. Finally, the preparative enzymatic methylation catalyzed by PsmD_Sa was achieved using different enzyme formulations: lysates, whole cells and immobilized enzymes. The reactions were carried out in combination with a cofactor recycling system and the stereoselective methylation was successfully achieved using various substrates and enzyme variants, in scales up to hundreds of milligrams. Overall, this study aimed to provide new insights into the practical aspects of methyltransferase biocatalysis and showcase the potential of PsmD_Sa as a useful tool for the stereoselective C methylation of indole derivatives. Die Biosynthese des Acetylcholinesterase (AChE)-Hemmers Physostigmin wurde für den produzierenden Organismus Streptomyces Griesofuscus beschrieben, und es wurde festgestellt, dass sie einen stereoselektiven Methylierungsschritt umfasst, der durch die SAM-abhängige Methyltransferase PsmD katalysiert wird, die die Konfiguration der Endverbindung bestimmt und die Bildung des spezifischen Pyrroloindolrings auslöst. Mehrere Analoga von PsmD-Produkten haben bereits eine Hemmung von AChE gezeigt, was die strukturelle Diversifizierung von PsmD-Produkten zu einer interessanten Perspektive macht, da sie das Potenzial zur Identifizierung neuer Arzneimittelkandidaten zur Behandlung verwandter neurologischer Erkrankungen bietet. Es wurde eine neue PsmD-ähnliche Indol-C Methyltransferase identifiziert, die aus Streptomyces albulus (noursei) stammt (PsmD_Sa). Das Enzym wurde exprimiert und auf Struktur, Mechanismus und biochemische Eigenschaften hin analysiert. Die biochemische Analyse ergab eine höhere Stabilität im Vergleich zu seinem zuvor charakterisierten Homologen aus Streptomyces griseofuscus (PsmD_Sg), wobei die Stereoselektivität der Methylierungsreaktion erhalten blieb. Die Kristallstruktur von PsmD_Sg wurde in Zusammenarbeit mit Prof. Dr. Oliver Weiergräber (IBI-7: Strukturelle Biochemie, Forschungszentrum Jülich) experimentell mittels Röntgenspektroskopie bestimmt und als Vorlage für die präzise in silico Modellierung der PsmD_Sa Struktur verwendet. Mittels ortsgerichteter Mutagenese wurde die katalytische Stelle kartiert und der Mechanismus von PsmD_Sa aufgeklärt. Die Ergebnisse wurden durch molekulares Docking und molekulardynamische Simulationen von Dr. Benoit David (IBG-4: Bioinformatik, Forschungszentrum Jülich) untermauert, die einen Überblick über die PsmD-Katalyse bieten. Es wurde ein beweglicher N-terminaler „Deckel“ identifiziert, der eine entscheidende Rolle bei der Auslösung des katalytischen Prozesses nach der Bindung des Substrats und des Cofaktors spielt. Es wurde festgestellt, dass eine katalytische Glu-His-Tyr-Triade das Substrat durch eine Protonen-Shuttle-Aktion aktiviert. Das semi-rationale Engineering von PsmD_Sa führte zur Verbesserung seiner Aktivität gegenüber sperrigen, nicht-natürlichen indolhaltigen Substraten. Fünf Positionen in der katalytischen Stelle wurden nacheinander durch Sättigungsmutagenese angepeilt, wodurch gezielte Mutantenbibliotheken entstanden. Zur Generierung und zum Screening der resultierenden Mutantenbibliotheken wurde die integrierte Laborplattform AutoBioTech in Zusammenarbeit mit Dr. Julia Tenhaef (IBG-1: Biotechnologie, Forschungszentrum Jülich) eingesetzt. Ein modularer Ansatz wurde entwickelt, um die Enzymexpression, enzymatische Reaktionen und das Aktivitätsscreening in 96-Well-Mikrotiterplatten zu automatisieren. Für das effiziente Screening der resultierenden Mutantenbibliotheken wurde ein neuer kolorimetrischer Hochdurchsatz-Assay zum Indol-Nachweis entwickelt. Der Assay ermöglicht den Nachweis der PsmD-Substratkonzentration in Gegenwart des isolierten Enzyms sowie unter Verwendung von Ganzzell-Biokatalysatoren. Das Engineering und Screening der PsmD_Sa-Varianten führte zur Identifizierung neuer Mutanten mit deutlich verbesserter Aktivität für die getesteten Substrate, und es wurde festgestellt, dass die Schlüsselposition 166 eine wichtige Rolle bei der produktiven Bindung sperriger Substratderivate spielt. Die ortsgerichtete Mutagenese von PsmD_Sa zielte darauf ab, seine Alkylierungskapazität unter Verwendung eines ethylierten SAM-Cofaktor-Derivats (SAE) zu erweitern. Zwei enzymatische SAE-Versorgungssysteme wurden in Kaskade mit PsmD_Sa und den neuen Mutanten verwendet. Die gekoppelten PsmD_SAE-Versorgungssysteme wurden optimiert, was zu einer 7-fachen Verbesserung der PsmD-katalysierten Umwandlung zum ethylierten Produkt unter Verwendung des Wildtyp-Enzyms führte. Zwei Mutanten, A125G und F126L, schnitten bei den Reaktionen mit verschiedenen SAM-Cofaktor-Derivaten besser ab als der Wildtype. Schließlich wurde die von PsmD_Sa katalysierte präparative enzymatische Methylierung mit verschiedenen Enzymformulierungen durchgeführt: Lysate, ganze Zellen und immobilisierte Enzyme. Die Reaktionen wurden in Kombination mit einem Cofaktor-Recycling-System durchgeführt, und die stereoselektive Methylierung wurde erfolgreich mit verschiedenen Substraten und Enzymvarianten in Größenordnungen bis zu Hunderten von Milligramm erreicht. Insgesamt sollte diese Studie neue Erkenntnisse über die praktischen Aspekte der Methyltransferase-Biokatalyse liefern und das Potenzial von PsmD_Sa als nützliches Werkzeug für die stereoselektive C-Methylierung von Indolderivaten aufzeigen.
Lizenz:	Dieses Werk ist lizenziert unter einer Creative Commons Namensnennung 4.0 International Lizenz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Chemie » Bioorganische Chemie
Dokument erstellt am:	25.03.2026
Dateien geändert am:	25.03.2026
Promotionsantrag am:	14.03.2025
Datum der Promotion:	31.10.2025