Dokument: Functional characterization of two major membrane transport proteins in excitatory signaling: vesicular glutamate transporters and voltage-gated calcium channels

Titel:	Functional characterization of two major membrane transport proteins in excitatory signaling: vesicular glutamate transporters and voltage-gated calcium channels
Weiterer Titel:	Funktionelle Charakterisierung zweier zentraler Membrantransportproteine der exzitatorischen Signalübertragung: vesikuläre Glutamattransporter und spannungsabhängige Calciumkanäle
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=72046
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20260203-095722-4
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Lugo Garcia, Victor Manuel [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 18,18 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 26.01.2026 / geändert 26.01.2026
Beitragende:	Prof. Dr. Fahlke, Christoph [Gutachter] Prof. Dr. Rose, Christine [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Excitatory signaling is a fundamental mechanism underlying neuronal communication, shaping processes that range from brain development to sensory perception. In the mammalian brain, glutamate serves as the primary excitatory neurotransmitter. Two key steps underlying glutamatergic transmission are the packaging of glutamate into synaptic vesicles by vesicular glutamate transporters (VGLUTs) and the entry of calcium through voltage-gated calcium (CaV) channels, which triggers vesicular glutamate release. This thesis characterizes the functional properties of VGLUT variants and analyzes the effects of protein–protein interactions on CaV channel surface expression and function. VGLUTs harness the transmembrane proton potential (Δ ̃𝜇H+) generated by the vacuolar-type H+-ATPase (V-ATPase) to accumulate glutamate within synaptic vesicles. The functional properties of VGLUTs thus constitute a major determinant of synaptic strength. In addition to transporting glutamate, VGLUTs function as chloride channels. The first aim of this investigation was to characterize the molecular mechanisms that underlie this anion conductance. Structure-guided mutagenesis of rat VGLUT1 (rVGLUT1) identified residues that shape pore properties, gating kinetics, and the pH dependence of the anion channel. The Drosophila ortholog DVGLUT was subsequently analyzed for functional comparison with its mammalian counterparts. Similar to rVGLUT1, DVGLUT functions as a glutamate/proton exchanger. However, the DVGLUT channel showed distinct differences in luminal chloride–dependent modulation and anion conduction. Finally, a VGLUT3 mutation associated with human deafness was evaluated in the mouse ortholog. This study revealed notable biophysical differences in channel properties compared with wild-type transporters. Together, these investigations advance the understanding of structure–function relationships underlying VGLUT activity and, in turn, synaptic vesicle filling and excitatory neurotransmission. CaV channels are expressed both pre- and postsynaptically, where they couple membrane depolarization to calcium influx. At presynaptic terminals, Ca2+ entry through CaV channels triggers neurotransmitter release, whereas in postsynaptic dendrites it modulates excitability and synaptic plasticity. The expression levels and functional states of CaV channels at the plasma membrane constitute major determinants of synaptic strength and neuronal function. The core components of CaV channels are the pore-forming 𝛼1 -subunit and the auxiliary 𝛽-subunit. The 𝛽-subunit promotes intracellular trafficking of the CaV𝛼1 subunit to the plasma membrane and engages in multiple protein–protein interactions that modulate channel activity. Actin, responsible for maintaining cell shape and facilitating intracellular trafficking, associates with the neuronal CaV𝛽-subunit to regulate vesicle pool availability. This study investigated the effects of actin-association–deficient CaV𝛽 mutants on CaV channel surface expression and function. The results revealed a role for actin–CaV𝛽 interactions in removing functionally impaired CaV channels. Actin–CaV𝛽 coupling thus represents a mechanism that ensures reliable calcium signaling at the plasma membrane. Erregende Signalübertragung ist ein grundlegender Mechanismus der neuronalen Kommunikation und prägt Prozesse, die von der Gehirnentwicklung bis zur sensorischen Wahrnehmung reichen. Im Säugetiergehirn dient Glutamat als primärer erregender Neurotransmitter. Zwei entscheidende Schritte der glutamatergen Transmission sind das Verpacken von Glutamat in synaptische Vesikel durch vesikuläre Glutamattransporter (VGLUTs) sowie der Einstrom von Calcium über spannungsabhängige Calciumkanäle (CaV), der die vesikuläre Glutamatfreisetzung auslöst. Diese Arbeit charakterisiert die funktionellen Eigenschaften verschiedener VGLUT-Varianten und untersucht die Auswirkungen von Protein–Protein-Wechselwirkungen auf die Oberflächenexpression und Funktion von CaV-Kanälen. VGLUTs nutzen das transmembrane Protonenpotential (Δ ̃𝜇H + ), das durch die vakuoläre H + -ATPase (V-ATPase) erzeugt wird, um Glutamat in synaptischen Vesikeln anzureichern. Die funktionellen Eigenschaften der VGLUTs stellen somit einen wesentlichen Faktor für die synaptische Stärke dar. Neben dem Transport von Glutamat fungieren VGLUTs als Chloridkanäle. Das erste Ziel dieser Arbeit bestand darin, die molekularen Mechanismen zu charakterisieren, die dieser Anionenleitfähigkeit zugrunde liegen. Durch strukturgeleitete Mutagenese von Ratten-VGLUT1 (rVGLUT1) konnten Aminosäurereste identifiziert werden, die die Poreneigenschaften, die Gating-Kinetik und die pH-Abhängigkeit des Anionenkanals bestimmen. Anschließend wurde das Drosophila-Ortholog DVGLUT funktionell mit seinen Säugetierhomologen verglichen. Ähnlich wie rVGLUT1 fungiert DVGLUT als Glutamat/Proton-Austauscher, zeigte jedoch deutliche Unterschiede in der luminalen, chloridabhängigen Modulation und der Anionenleitung. Schließlich wurde eine VGLUT3-Mutation, die mit menschlicher Taubheit assoziiert ist, im Maus-Ortholog untersucht. Diese Studie offenbarte bemerkenswerte biophysikalische Unterschiede in den Kanaleigenschaften im Vergleich zu Wildtyp-Transportern. Insgesamt erweitern diese Untersuchungen das Verständnis der Struktur–Funktions-Beziehungen, die der VGLUT-Aktivität und damit der Vesikelfüllung und erregenden Neurotransmission zugrunde liegen. CaV-Kanäle werden sowohl prä- als auch postsynaptisch exprimiert, wo sie die Membrandepolarisation mit dem Calciumeinstrom koppeln. In präsynaptischen Endigungen löst der Ca2+-Einstrom über CaV-Kanäle die Neurotransmitterfreisetzung aus, während er in postsynaptischen Dendriten die Erregbarkeit und synaptische Plastizität moduliert. Die Expressionsniveaus und funktionellen Zustände von CaV-Kanälen an der Plasmamembran stellen zentrale Determinanten der synaptischen Stärke und neuronalen Funktion dar. Die Kernkomponenten der CaV-Kanäle sind die porenbildende 𝛼1 -Untereinheit und die Hilfsuntereinheit 𝛽. Die 𝛽-Untereinheit fördert den intrazellulären Transport der CaV 𝛼1 -Untereinheit zur Plasmamembran und geht vielfältige Protein–Protein-Wechselwirkungen ein, die die Kanalaktivität modulieren. Aktin, das für die Aufrechterhaltung der Zellform und die Vermittlung des intrazellulären Transports verantwortlich ist, bindet an die neuronale CaV 𝛽-Untereinheit und reguliert so die Verfügbarkeit von Vesikelpools. Diese Arbeit untersuchte die Auswirkungen von Aktinassoziations-defizienten CaV 𝛽-Mutanten auf die Oberflächenexpression und Funktion der CaV-Kanäle. Die Ergebnisse zeigen, dass die Aktin–CaV 𝛽-Wechselwirkung eine Rolle bei der Entfernung funktionell beeinträchtigter CaV-Kanäle spielt. Die Kopplung zwischen Aktin und CaV 𝛽 stellt somit einen Mechanismus dar, der eine verlässliche Calciumsignalübertragung an der Plasmamembran gewährleistet
Lizenz:	Dieses Werk ist lizenziert unter einer Creative Commons Namensnennung 4.0 International Lizenz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät
Dokument erstellt am:	03.02.2026
Dateien geändert am:	03.02.2026
Promotionsantrag am:	12.11.2025
Datum der Promotion:	22.01.2026