Dokument: Interplay of Inositol Pyrophosphate Pathway and Iron-Sulfur Cluster Biogenesis
| Titel: | Interplay of Inositol Pyrophosphate Pathway and Iron-Sulfur Cluster Biogenesis | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=71821 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20260126-125545-1 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Englisch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Axinte, Bianca-Georgiana [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Jun.-Prof. Dr. Span, Ingrid [Gutachter] Dr. Fleig, Ursula Nicole [Gutachter] | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie | |||||||
| Beschreibungen: | Inositolphosphaten (IPs), einschließlich Inositolpyrophosphaten (IPPs), sind vielseitige kleine Molekülbotenstoffe, die eine entscheidende Rolle bei zellulären Entscheidungsprozessen spielen. IPs sind an verschiedenen biologischen Prozessen beteiligt, z. B. an der Insulinsignalübertragung, der Tumorzellmotilität, der Apoptose und der Phosphathomöostase. Das Protein Asp1 ist ein Mitglied der hochkonservierten PPIP5K Familie und spielt eine wichtige Rolle bei der Regulierung des intrazellulären IPP Spiegels. Es handelt sich um ein Enzym mit zwei Domänen, wobei die N terminale Domäne als Kinase und die C-terminale Domäne als Pyrophosphatase fungiert. Kürzlich wurde festgestellt, dass die Pyrophosphatase Domäne einen Eisen Schwefel (Fe S) Cluster bindet. Strukturelle Vorhersagen und spektroskopische Untersuchungen haben jedoch widersprüchliche Informationen über die Struktur und den Ort des Clusters ergeben. Dieser Aspekt ist sehr faszinierend, da die PPIP5K Familie hoch konserviert ist und Asp1 als funktionelles und strukturelles Modell für die gesamte Familie angesehen werden könnte, was neue Perspektiven für zelluläre Funktionen und katalytische Aktivitäten eröffnen würde.
Ziel dieser Arbeit war es, neue Erkenntnisse über die Struktur, die Lage und die Rolle des Fe S Clusters in der Pyrophosphatasedomäne von Asp1 zu gewinnen. Frühere Studien standen vor der Herausforderung, genügend Proben für strukturelle und spektroskopische Untersuchungen herzustellen. Daher wurden neue Konstrukte für die heterologe Proteinproduktion entwickelt und bewertet. Es zeigte sich, dass die Verwendung einer für die Expression in Echerichia coli optimierten Sequenz die Proteinausbeute erheblich steigern konnte. Die Entfernung der 20 Aminosäuren am C terminalen Ende führte jedoch nicht zu einer weiteren Steigerung der Proteinausbeute und stabilität. Um den Ort des Clusters zu identifizieren, wurden Rückstände in der Nähe der vorgeschlagenen aktiven Stelle, die an der Bindung des Clusters beteiligt sein könnten, mutiert und ihre Rolle bei der Ligation untersucht. Auf der Grundlage von Alphafold2 Vorhersagen wurden die Aminosäurereste an den Positionen 397, 607, 643, 644, 663 und 868 durch ortsgerichtete Mutagenese ausgetauscht. Spektroskopische Untersuchungen ergaben, dass die Reste 397, 607 und 663 wahrscheinlich den Cluster koordinieren, während die Reste 643, 644 und 868 höchstwahrscheinlich nicht Teil der ersten Koordinationssphäre des Clusters sind. 57Fe, das Asp1 enthält, wurde genutzt, um die Struktur des Fe S Clusters mithilfe der Mössbauer Spektroskopie zu bestimmen. Die spektroskopischen Daten weisen die Form des Fe S Clusters in Asp1 nach. Schließlich wurde im Rahmen dieser Arbeit der oligomere Zustand von Asp1395-920 in An und Abwesenheit des Fe S Clusters untersucht. Die Ergebnisse bestätigen, dass Asp1 überwiegend als Dimer vorkommt, wie aus der Literatur bekannt, und dass es in einen monomeren Zustand übergeht, wenn vier Eisenatome pro Proteinmonomer gebunden sind. Darüber hinaus hat die Wahl der Reagenzien während der chemischen Rekonstitution oder der chromatographischen Experimente keinen Einfluss auf den oligomeren Zustand von Asp1. Insgesamt wirft diese Arbeit Licht auf die Möglichkeit, dass die Asp1 Pyrophosphatase Domäne von Schizosaccharomyces pombe einen [2Fe 2S] Cluster in verschiedenen Regionen bindet, wie bisher angenommen, und dass eine Erhöhung des Eisengehalts den oligomeren Zustand von Asp1 beeinflusst.Inositol phosphates (IPs), including inositol pyrophosphates (IPPs), are versatile small molecule messengers that play a critical role in cellular decision-making processes. IPs have been implicated in diverse biological processes such as insulin signaling, tumor cell motility, apoptosis, and phosphate homeostasis. The protein Asp1 is a member of the highly conserved PPIP5K family and plays an important role in modulating the intracellular IPP levels. It is a two domain enzyme in which the N terminal domain functions as a kinase and the C terminal domain functions as a pyrophosphatase. Recently, it was found that the pyrophosphatase domain binds an iron sulfur (Fe S) cluster. However, conflicting information about the structure and location of the cluster has emerged from structural predictions and spectroscopic studies. This aspect is highly fascinating since the PPIP5K family is highly conserved and Asp1 could be considered a functional and structural model for the entirety of the family, opening new perspectives for cellular functions and catalytic activities. The aim of this work was to gain new insights into the structure, location, and role of the Fe S cluster in the pyrophosphatase domain of Asp1. Previous studies have faced the challenge of producing sufficient samples for structural and spectroscopic studies. Therefore, new constructs for heterologous protein production were generated and evaluated. It was shown that using a codon optimized sequence for expression in E. coli could enhance the protein yield significantly but removing the 20 amino acids at the C terminal end did not increase the protein yield and stability further. To identify the location of the cluster, residues that were close to the proposed active site and that could be involved in cluster binding were mutated and their role in ligation was investigated. Based on Alphafold2 predictions, the amino acid residues at position 397, 607, 643, 644, 663, and 868 were exchanged by site directed mutagenesis. Spectroscopic studies suggested that residues 397, 607, and 663 are likely to coordinate the cluster, while residues 643, 644, and 868 are most likely not part of the first coordination sphere of the cluster. 57Fe containing Asp1 was produced to determine the structure of the Fe S cluster using Mössbauer spectroscopy. The spectroscopic data identify the Fe S cluster form in Asp1. Lastly, the oligomeric state of Asp1395-920 was investigated as part of this thesis in the presence and absence of the Fe S cluster. The results confirm that Asp1 is found predominantly as dimer as known from literature and that it transitions to a monomeric state when four iron atoms are bound per protein monomer. In addition, the choice of reagents during chemical reconstitution or chromatographic experiments does not influence the oligomeric state of Asp1. Overall, this thesis sheds light on the possibility that the S. pombe Asp1 pyrophosphatase domain binds an [2Fe 2S] cluster in different regions as previously assumed and that an increase in iron content influences the oligomeric state of Asp1. | |||||||
| Lizenz: |  Dieses Werk ist lizenziert unter einer Creative Commons Namensnennung 4.0 International Lizenz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Physikalische Biologie | |||||||
| Dokument erstellt am: | 26.01.2026 | |||||||
| Dateien geändert am: | 26.01.2026 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 16.07.2025 | |||||||
| Datum der Promotion: | 28.11.2025 |
